煙草疫霉菌分子變異研究.pdf

1、煙草黑脛?。≒hytophthora nicotianae）是煙葉生產(chǎn)上最重要的病害之一，主要發(fā)生在我國(guó)南方，對(duì)煙葉生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。該病菌可侵染多種茄科植物，以病殘?bào)w形式在土壤中越冬存活。為深入了解煙草黑脛病菌的發(fā)生和變異規(guī)律，并為科學(xué)防治該病害提供理論基礎(chǔ)，本文采用選擇性培養(yǎng)基從采自全國(guó)各地的煙草黑脛病樣品中分離獲得了大量菌株，并采用分子生物學(xué)方法，對(duì)其分子遺傳變異規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本文主要開(kāi)展了如下四方面的研究工作:
　　

2、1.本試驗(yàn)采用選擇性培養(yǎng)基，以胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)寄自全國(guó)各地的疑似煙草黑脛病莖稈標(biāo)本進(jìn)行病菌分離。通過(guò)多次改良選擇性培養(yǎng)基的藥物配方試驗(yàn)，最后在胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基CA的基礎(chǔ)上，研制出了適于煙草黑脛病菌分離的有效培養(yǎng)基，其藥物配方為:利發(fā)霉素10mg(100％，上海生工生物工程有限公司)，氨芐西林5mg(100％，香港聯(lián)邦制藥廠有限公司)，五氯硝基苯5mg(20％，山西綠海農(nóng)藥科技有限公司)，多菌靈5mg（60％，山東淄博恒生

3、農(nóng)藥有限公司），鏈霉素0.35mg(100％，上海生工生物工程有限公司)。采用該培養(yǎng)基可有效抑制其他霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而利于成功分離煙草黑脛病菌。
　　2.采用3種菌絲破壁方法與3種試劑提取方法相結(jié)合的9種方法，比較研究了煙草黑脛病菌菌絲基因組DNA的提取方法。結(jié)果表明，采用液氮研磨+CTAB/SDS提取法、液氮研磨+EZ-kit提取法和電鉆研磨+EZ-kit提取法獲得的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EF-1α-PCR擴(kuò)增及瓊脂

4、糖凝膠電泳檢測(cè)品質(zhì)較好。在此基礎(chǔ)上，利用ISSR引物UBC#808對(duì)三種待測(cè)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證明上述3種方法提取的基因組DNA適合于ISSR反應(yīng)。
　　3.采用28s rRNA和β-tubulin基因序列分析方法，對(duì)來(lái)自全國(guó)各地的煙草疫霉代表菌株進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，供試菌株的28s rRNA序列差異較小，相似度較高，聚類結(jié)果可為兩個(gè)群。供試菌株得到的β-tubulin基因序列與NCBI的序列比對(duì)，相似度為99％，確定