IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸對(duì)體外培養(yǎng)新生牛脂肪細(xì)胞HSL mRNA豐度和酶活性的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)選取臨床檢查無(wú)異常的新生荷斯坦?fàn)倥ｎi動(dòng)脈放血致死，無(wú)菌開(kāi)腹切取腹腔內(nèi)小腸網(wǎng)膜約60g，D-Hank’s液洗滌，分離去除脂肪組織中肉眼可見(jiàn)的纖維成份及血管，按照本實(shí)驗(yàn)室建立的犢牛前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行脂肪細(xì)胞的原代單層培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)期為14d。培養(yǎng)至第8、12d，用油紅0工作液和臺(tái)盼藍(lán)工作液對(duì)脂肪細(xì)胞分別進(jìn)行染色，以便觀察其形態(tài)；第14d，選取體外培養(yǎng)單層生長(zhǎng)良好的脂肪細(xì)胞，在培養(yǎng)介質(zhì)中分別添加0、10、20、30、40、50μg/L

2、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)，0、100、250、500、750、1000nmol/L胰高血糖素樣肽I(GLP-I)，0、10、20、30、40、50mg/L乳酸(每濃度梯度設(shè)三個(gè)重復(fù))，再分別進(jìn)行培養(yǎng)24tl后提取細(xì)胞總RNA，20倍稀釋后用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculator測(cè)定總RNA的濃度和純度，并用DEPC-H<,2>O將所有樣品的總RNA濃度調(diào)節(jié)一致(以消除提取RNA過(guò)程中總RNA

3、含量差異，確保定量精確性)。將常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增HSL mRNA模板的純化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒的重組、克隆和序列測(cè)定。用滅菌純水將以上重組質(zhì)粒按梯度稀釋后作為熒光定量PCR反應(yīng)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板，按已建立的PCR反應(yīng)體系和條件在ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，機(jī)器自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將，IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細(xì)胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以標(biāo)準(zhǔn)曲線為參照在ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增

4、，數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，觀察IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細(xì)胞HSL mRNA豐度的變化。IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細(xì)胞在低溫操作室參照南京凱基總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用華特生蛋白定量試劑盒測(cè)定所提細(xì)胞總蛋白濃度，最后用南京建成脂肪酶測(cè)定試劑盒測(cè)定IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細(xì)胞HSL活性變化，數(shù)據(jù)同樣用SPSS40.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1.IGF-I、GLP-I、乳酸對(duì)H

5、SL mRNA表達(dá)的抑制作用存在劑量依賴性。[GF-I濃度>20pg/L、GLP-I濃度≥100nmol/L、乳酸濃度>20mg/L時(shí)對(duì)I-ISL mRNA的表達(dá)抑制作用顯著(P<0.05或0.01)。2.IGF-I、GLP-I、乳酸對(duì)HSL活性的抑制作用同樣存在劑量依賴性。IGF-I濃度>30pg/L、GLP-I濃度≥100nmol/L、乳酸濃度>40mg/L時(shí)對(duì)}tSl?；钚缘囊种谱饔妹黠@(P<0.05或0.01)。3.IGF-I、