大豆GmGCHI和GmADCS基因共表達(dá)對(duì)擬南芥葉酸含量的影響.pdf

1、葉酸在生物體生命活動(dòng)中起著必不可少的作用，它主要介導(dǎo)一碳單位的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。葉酸分子由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸三部分組成。植物中葉酸的合成涉及到3個(gè)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu):蝶呤分支在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，pABA分支在葉綠體中進(jìn)行，二者在線粒體中最終合成葉酸。GCHI基因編碼喋啶分支的GTP環(huán)化水解酶，ADCS基因編碼pABA分支的氨基脫氧分支酸合酶，這兩個(gè)酶是葉酸合成途徑的限速酶，對(duì)葉酸的合成起著至關(guān)重要的作用。本研究在擬南芥中同時(shí)共表達(dá)

2、大豆GmGCHI和GmADCS基因提高了擬南芥葉酸的含量，為作物葉酸代謝工程研究開(kāi)辟了新的途徑。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)獲得了GmGCHI轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系，利用RT-PCR驗(yàn)證了GmGCHI基因在擬南芥中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。HPLC-MS/MS法測(cè)定葉酸含量顯示:GmGCHI轉(zhuǎn)基因擬南芥的總?cè)~酸含量、5-甲基四氫葉酸（5-CH3-THF）及5-甲酰四氫葉酸（5-CHO-THF）含量均高于野生型植株

3、，其中，GmGC HI122及GmGCHI127株系葉酸含量與野生型有顯著差異。GmGCHI轉(zhuǎn)基因擬南芥葉酸含量比野生型平均提高了40％，單株系最高提高了57％;5-CH3-THF含量比野生型平均提高了43％，單株系最高提高了56％;5-CHO-THF含量比野生型平均提高了69％，單株系最高提高了94％。
　　 2.通過(guò)潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)獲得了GmADCS轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系，利用RT-PCR驗(yàn)證了GmADCS基因在擬南

4、芥中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 3.將篩選到的GmGCHI轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系和GmADCS轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系進(jìn)行雜交，通過(guò)PCR檢測(cè)獲得了兩基因共表達(dá)的擬南芥植株。HPLC-MS/MS法測(cè)定葉酸含量顯示:GmGCHI和GmADCS基因共表達(dá)的擬南芥植株總?cè)~酸含量、5-CH3-THF、5-CHO-THF含量比野生型有極顯著或顯著提高，比GmGCHI轉(zhuǎn)基因擬南芥植株有明顯提高，其中總?cè)~酸含量比它們分別平均提高了85％和21％，最高提高了

5、111％和37％;5-CH3-THF含量比它們分別平均提高了83％和19％，最高提高了113％和36％;5-CHO-THF含量比它們分別平均提高了128％和27％，最高提高了156％和55％。研究表明大豆GmGCHI和GmADCS基因在擬南芥中共表達(dá)可以顯著提高葉酸的含量。
　　 4.構(gòu)建了家蠶表達(dá)系統(tǒng)重組pV11393-GmGCHI和pV11393-GmADCS轉(zhuǎn)移載體，為GmGCHI和GmADCS蛋白的體外表達(dá)、酶學(xué)活性研究