豬鏈球菌2型新型溶血相關(guān)基因鑒定及功能研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcussuis，S.suis）是一種重要的人畜共患病痛原，能引起豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等多種病癥。在33個(gè)血清型中，豬鏈球菌2型（Streptococcussuistype2，SS2）流行最廣、毒力最強(qiáng)。近年來(lái)，SS2引起的豬鏈球菌病在我國(guó)有兩次暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，帶來(lái)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。盡管已報(bào)道了多種該菌的毒力因子，其致病機(jī)理仍不清晰。本研究以SS2新型溶血相關(guān)基因Hhly3為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建

2、基因缺失突變株，比較生物學(xué)特性，研究Hhly3在SS2致病過(guò)程中的作用。研究結(jié)果豐富了對(duì)該菌致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
　　1、豬鏈球菌2型新型溶血相關(guān)基因分布及蛋白定位
　　我國(guó)近兩次流行的SS2菌株有89KPAI這一重要毒力標(biāo)志。Hhly3基因是通過(guò)差減抑制雜交篩選到的位于89KPAI上的SS2可能毒力基因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因序列分析，克隆表達(dá)，基因分布檢測(cè)，蛋白定位檢測(cè)等方法鑒定Hhly3基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Hhly3基因編碼78k

3、Da蛋白，含有8段跨膜結(jié)構(gòu)，與溶血素Ⅲ型超家族有共同的保守區(qū)域。待檢31株S.suis菌株中，Hhly3主要存在于SS2中國(guó)強(qiáng)毒分離株，基因分布情況與89KPAI分布情況一致。此外Westernblot證實(shí)其編碼具有良好免疫原性的細(xì)胞膜蛋白，為假定四型分泌系統(tǒng)重要通道蛋白。
　　2、豬鏈球菌2型Hhly3基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析
　　為了進(jìn)一步研究Hhly3基因在SS2致病過(guò)程中的作用，利用溫度敏感型穿梭自殺質(zhì)粒pS

4、ET4s定點(diǎn)敲除SS2ZY05719的Hhly3基因，構(gòu)建了Hhly3基因缺失株△Hhly3，并構(gòu)建互補(bǔ)株C△Hhly3作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hhly3編碼蛋白具有溶血性活性，與野毒株比較，Hhly3缺失導(dǎo)致SS2溶血活性顯著降低(P＜0.01)。作為假定通道蛋白，HHLY3的缺失使sly表達(dá)下降76％，導(dǎo)致SS2上清溶血性大幅下降，SS2細(xì)胞毒性降低。此外，系列實(shí)驗(yàn)顯示△Hhly3在全血存活、酸堿耐受、粘附上皮細(xì)胞、生物被膜形成以及毒

5、力因子表達(dá)等方面能力顯著降低(P＜0.05)。對(duì)斑馬魚(yú)致病力，△Hhly3(LDs0=1.30×106CFU)顯著弱于野毒株(LD50=2.39×105CFU)。綜上所述，Hhly3基因作為新型外源毒力因子在SS2溶血、定植及感染方面發(fā)揮重要作用。
　　3、Hhly3-ref雙基因缺失株的構(gòu)建及特性分析
　　假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ref以及溶血相關(guān)基因Hhly3均是通過(guò)SSH篩選位于SS2Tn916上的差異基因，ref基因是否對(duì)溶