豬急性期蛋白表達分析及應(yīng)激相關(guān)標志物的蛋白組學(xué)篩選.pdf

1、本試驗旨在篩選和驗證豬血清及肝臟組織中蛋白質(zhì)類應(yīng)激指標，并尋找它們在不同應(yīng)激模式下的變化規(guī)律，為畜牧業(yè)生產(chǎn)實際中監(jiān)測動物應(yīng)激、提高動物健康福利水平提供理論依據(jù)。試驗選取健康斷奶大白豬和二花臉豬以及杜長大三元雜交豬和淮豬進行品種間比較，分析了血液常規(guī)生理生化指標、血清急性期蛋白(APP)含量以及皮質(zhì)醇、TNF-α等的濃度;分別研究了ACTH或LPS注射后豬肝臟和血清中APP基因和蛋白的表達情況，以及血液常規(guī)指標、血清皮質(zhì)醇、TNF-α等的

2、變化情況，并采用2-DE/MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)篩選了ACTH注射后的肝臟以及LPS刺激下豬的血清中可能存在的蛋白類生物標志物。
　　1.不同品種間豬急性期蛋白及其它應(yīng)激相關(guān)指標的比較
　　選取斷奶(25d)大白豬5頭、二花臉豬6頭，屠宰后采集肝臟、血液樣品;杜長大三元雜交豬生長期(40-50kg)13頭、育肥期(80-90kg)11頭，生長期和育肥期淮豬各10頭，于頸部靜脈采集血液樣品。采用熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附

3、法（Elisa法）和放射免疫檢測法分析了各品種豬肝臟APP的基因表達和血清APP、皮質(zhì)醇、TNF-α的濃度變化，采用自動生化分析儀對血細胞常規(guī)和常規(guī)生化指標進行了檢測。結(jié)果顯示:中國內(nèi)地豬種與進口品種相比，有較高的(P＜0.01)皮質(zhì)醇和更低的(P＜0.01)TNF-α水平，且淮豬生長期血清皮質(zhì)醇濃度顯著高于育肥期(P＜0.05)。APPs基因表達除二花臉豬HP有高于大白豬的趨勢（P=0.093）外，其他APP均無顯著變化;蛋白水平上，

4、HP在淮豬和三元豬間表現(xiàn)出品種與生長階段的雙重差異(P＜0.05)，Pig-MAP在不同生長階段間差異顯著（P＜0.05），二花臉豬HP、Pig-MAP和TTR血清濃度顯著高于大白豬(P＜0.05)。血液常規(guī)指標三元雜交豬和淮豬的紅細胞數(shù)目、紅細胞壓積及平均血紅蛋白含量在品種和生長階段均出現(xiàn)顯著差異，淋巴細胞和中性粒細胞數(shù)目有品種差異(P＜0.01)，血小板數(shù)目在不同階段間差異明顯（P＜0.05)，淮豬均顯著高于三元雜交豬。淮豬HDL-

5、C顯著高于三元雜交豬;而HDL-C表現(xiàn)正好相反，且生長期顯著高于育肥期（P＜0.01）;不同生長階段比較，育肥期血清GSH-PX和SOD含量極顯著低于生長期(P＜0.01)。此外，對各項檢測指標間的相關(guān)性進行分析:CRP與HP、Pig-MAP三者間顯著相關(guān)，Pig-MAP與HDL-C相關(guān)性顯著;紅細胞數(shù)目、紅細胞壓積等血細胞指標之間有很強的關(guān)聯(lián)(P＜0.05)，并且二者與皮質(zhì)醇相關(guān)性顯著（r值分別為0.38，0.47，P＜0.05）。以

6、上結(jié)果說明在同樣的養(yǎng)殖條件下中國地方豬種所遭受的應(yīng)激要小于引進品種，在膽固醇等物質(zhì)代謝模式上顯著優(yōu)于外來豬種;同時所得試驗數(shù)據(jù)證明了皮質(zhì)醇、TNF-α和HP、Pig-MAP等作為動物應(yīng)激標志物的實用性，為不同品種豬的生理特性的研究提供了重要的理論依據(jù)。
　　2.肌注ACTH對豬肝臟蛋白組學(xué)及應(yīng)激相關(guān)指標的影響
　　選取15-20kg的三元雜交豬（杜洛克×長白×大白）16頭，分為ACTH注射組和自然對照組。試驗組每天9:00和

7、16:00兩次肌內(nèi)注射1IU/kgBW劑量ACTH，對照組注射等量生理鹽水，試驗時間7d。試驗結(jié)束后，屠宰并采集肝臟和血液樣品。采用熒光定量PCR、Elisa和放射免疫法分析了豬肝臟和血清中APP的基因與蛋白表達水平以及血清皮質(zhì)醇和TNF-α含量。結(jié)果表明ACTH刺激后肝臟APP基因表達和血清皮質(zhì)醇、TNF-α含量均無明顯變化，僅血清HP濃度出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)。采用2-DE/MALDI-TOF技術(shù)進一步分析該模型下豬肝臟蛋白表

8、達譜變化情況，結(jié)果從33個差異蛋白點中有32個得到陽性鑒定，它們代表27種不同蛋白質(zhì)，涉及了物質(zhì)代謝與運輸、細胞功能和生長周期調(diào)控以及免疫防御等生理功能。揭示了長期慢應(yīng)激狀態(tài)下動物肝臟蛋白發(fā)生的一系列變化，為動物健康、福利篩選了新的監(jiān)測指標，為減輕和避免動物應(yīng)激以及后續(xù)的科學(xué)研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。
　　3.LPS注射后豬血清中應(yīng)激標志物的篩選
　　選取12頭雄性杜長大三元雜交斷奶仔豬(28d)，隨機分為兩組，試驗組肌內(nèi)注

9、射2mL含15μg/kg體重的LPS（E.Coliserotype，Sigma），對照組注射等量生理鹽水。6h后屠宰并采集肝臟、血液樣本。檢測了肝臟APP的基因表達和血清中APP、TNF-α、皮質(zhì)醇的表達水平，結(jié)果顯示LPS注射組肝臟CRP、HP、Pig-MAP基因表達被顯著上調(diào)，TTR顯著下調(diào)(P＜0.001);血清中CRP、HP以及TNF-α、皮質(zhì)醇的濃度顯著上升(P＜0.05)。對LPS注射后豬的體表溫度和血清生化指標進行檢測，結(jié)

10、果表明體表溫度和血清肌酸酐含量明顯上升（P＜0.05），血清白蛋白有下降的趨勢（P=0.076）。以上應(yīng)激指標的顯著改變，證明該應(yīng)激模式下機體發(fā)生了劇烈的生理反應(yīng)，以抵抗LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性刺激，幫助機體恢復(fù)健康穩(wěn)態(tài)。
　　采用2-DE/MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析了血清蛋白表達譜的變化情況，結(jié)果從18個差異顯著的蛋白點中發(fā)現(xiàn)了10種不同蛋白質(zhì)，它們大部分都屬于經(jīng)典的APP定義范疇，從而驗證了急性應(yīng)激狀態(tài)下各種APP發(fā)生的顯著改