生長分化因子9對豬卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響及機制研究.pdf

1、采用胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)，可以有效地利用屠宰場廢棄的動物卵巢，大量廉價地在實驗室生產(chǎn)胚胎，這對加速我國家畜良種繁殖具有重要的現(xiàn)實意義。但目前豬卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎體外生產(chǎn)效率還比較低。GDF9作為一種重要的卵源旁分泌因子，具有促進(jìn)卵泡向雌性生殖方向發(fā)育，從而提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用。本研究通過向豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中單獨添加GDF9和抗GDF9抗體，從正反兩方面來探究GDF9對豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的生物學(xué)作用，為豬胚胎的

2、體外生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。主要實驗內(nèi)容如下:
　　第一部分GDF9對豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響
　　采集屠宰場廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后統(tǒng)計核成熟率，并對成熟卵母細(xì)胞用化學(xué)方法孤雌激活，48h后統(tǒng)計卵裂率，168h后統(tǒng)計囊胚率，并收集囊胚統(tǒng)計總細(xì)胞數(shù)。此外，收集培養(yǎng)44h的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行皮質(zhì)顆粒染色，統(tǒng)計胞質(zhì)成熟率。在本次試驗中，對未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行兩種處理，即在成熟培養(yǎng)液中分別加入GDF

3、9（濃度梯度為0，100，200，300 ng/mL）和抗GDF9抗體（濃度梯度為0，2.5，5，10μg/mL），然后檢測上述指標(biāo)。結(jié)果表明，GDF9對核成熟、胞質(zhì)成熟、卵裂及囊胚總細(xì)胞數(shù)無顯著影響，但可顯著提高囊胚率，且這種作用具有劑量依賴性，在濃度為200ng/mL時達(dá)到最大。
　　第二部分GDF9對豬卵母細(xì)胞體外成熟與發(fā)育微環(huán)境影響的研究
　　采集屠宰場廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后依據(jù)文獻(xiàn)方法

4、對卵丘細(xì)胞擴散情況進(jìn)行分析，并收集卵丘細(xì)胞，用血球計數(shù)板對卵丘細(xì)胞增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計，收集成熟培養(yǎng)液，用ELISA方法檢測培養(yǎng)液中孕酮含量。在本次試驗中，選取對胚胎發(fā)育有顯著差異的添加物濃度:200ng/mL的GDF9和10μg/mL抗GDF9抗體分別加入豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行處理，然后檢測上述指標(biāo)。結(jié)果表明，200ng/mL的GDF9可促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴散、增殖，抑制孕酮分泌，從而抑制黃體化，創(chuàng)造適合卵子發(fā)育的微環(huán)境。
　　第三部

5、分GDF9對豬卵丘細(xì)胞基因表達(dá)的研究
　　采集屠宰場廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后收集卵丘細(xì)胞，抽提其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將HAS2（與卵丘擴散相關(guān)）、CSTB（與囊胚發(fā)育相關(guān)）、FST（與卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育相關(guān)）基因與內(nèi)參基因ACTB同時進(jìn)行QPCR擴增，記錄各個基因擴增的的ct值。在本次試驗中，與第二部分相同，選取對胚胎發(fā)育有顯著差異的添加物濃度:200ng/mL的GDF9和10μ g/mL抗