雞傳染性支氣管炎病毒弱毒株的篩選.pdf

1、雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis,IB）是一種傳染性極高的急性呼吸道疾病，它的病原是雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV），臨床主要癥狀為喘氣、氣管啰音、咳嗽、流鼻液。IB對(duì)不同日齡的雞均易感，而目前生產(chǎn)中使用的疫苗因?yàn)椴煌逍虸BV的交叉保護(hù)差，常常達(dá)不到保護(hù)的作用，給家禽養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本課題對(duì)某地區(qū)IBV流行毒株進(jìn)行優(yōu)勢(shì)毒株的篩選，然后對(duì)其致弱，

2、進(jìn)而對(duì)致弱毒株的S1基因、N基因序列進(jìn)行分析比較，對(duì)研制新型弱毒疫苗具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究首先挑選5個(gè)地方分離株（GY毒株、HQ毒株、DP毒株、FJW毒株、WT毒株）和H120疫苗株，選擇氣管環(huán)組織作為培養(yǎng)系統(tǒng)，對(duì)病毒效價(jià)TOC-ID50進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果，得出GY、HQ、DP、FJW、WT毒株的TOC-ID50分別為10-5.5/mL、10-6.54/mL、10-4.69/mL、10-5.33/mL、10-5.72

3、/mL，H120疫苗株的TOC-ID50為10-4.85/mL。
　　制備各毒株的陽(yáng)性血清，然后采用固定病毒-稀釋血清的方法在氣管環(huán)培養(yǎng)物中做血清交叉中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示，整個(gè)交叉中和試驗(yàn)的抗原相關(guān)范圍介于37%～81%之間。抗原相關(guān)性最低的是 HQ毒株與 H120疫苗株；最高的是 DP毒株與H120疫苗。根據(jù)R值的判斷標(biāo)準(zhǔn)，R值大于25%屬于同一血清型，5個(gè)毒株都與H120疫苗株屬于相同血清型。綜合考慮后，選擇HQ毒株進(jìn)行下一步毒

4、株致弱的研究。
　　HQ毒株在9~11日齡SPF雞胚上連續(xù)傳代致弱，傳代至110代。傳代過(guò)程中，每隔4代的雞胚尿囊液使用1%胰酶37℃消化2 h，測(cè)試血凝效價(jià)。結(jié)果顯示，HQ毒株血凝效價(jià)穩(wěn)定在28到29的水平。
　　對(duì)HQ毒株P(guān)110(110代)進(jìn)行安全性、毒力穩(wěn)定性和免疫原性檢驗(yàn)。P110病毒原液接種1日齡雛雞，雞群生長(zhǎng)良好，未見發(fā)病癥狀。通過(guò)氣管環(huán)組織測(cè)定傳代后期的繁殖滴度，HQ毒株P(guān)90、P100、P110的TOC-I

5、D50穩(wěn)定在10-5.8~10-5.9/mL。對(duì)3組1日齡雛雞，分別接種不同毒量的110代病毒液（500 TOC-ID50、1000 TOC-ID50、3000 TOC-ID50），在接種后第7、14、21、28天收集血清，測(cè)試抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，最快達(dá)到50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率的接種劑量3000 TOC-ID50，在接種后第7天即可達(dá)到；能產(chǎn)生50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率的最小接種劑量為1000 TOC-ID50。通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，HQ毒株 P110對(duì)雛雞沒

6、有致病力、毒力穩(wěn)定、免疫原性良好，可以成為弱毒疫苗株的備選毒株。
　　對(duì)HQ毒株P(guān)10和P110的S1基因和N基因進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)軟件進(jìn)行分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與P10相比，P110的S1基因有9個(gè)堿基發(fā)生突變，集中在S1基因的N端和C端，分別在102位、193位、265位、311位、360位、826位、1040位、1478位、1603位發(fā)生改變。堿基突變進(jìn)而導(dǎo)致8個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變，在65位，His→Asn；在89位終止子 T

7、AG→CAG，插入Gln；在104位，Asn→Ser；在118位，Ser→Gly；在276位，Ala→Thr；在347位，Ser→Phe；在493位，Pro→Leu，在535位Ser→Ala。對(duì)S1基因推導(dǎo)氨基酸序列分析其潛在糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)P110在65～67位、273～275位有新的糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)，原本在P10103～105位的糖基化位點(diǎn)消失；進(jìn)行疏水性、表面抗原性比較，發(fā)現(xiàn)S1蛋白的疏水性沒有太大的變化，在100～108位的氨基酸