剛地弓形蟲GRA17、GRA23核酸疫苗及GRA17缺失株弱毒活疫苗的免疫保護性研究.pdf

1、弓形蟲?。═oxoplasmosis）是一種由弓形蟲感染引起的重要的人獸共患的寄生蟲病。弓形蟲可以感染幾乎所有的溫血動物（包括人），人類弓形蟲的感染率達到了三分之一左右，弓形蟲病傳染性很強，并且流行也非常廣泛。目前尚無穩(wěn)定、安全、有效的弓形蟲疫苗可用，因而研發(fā)高效的新型疫苗成為防控弓形蟲病的首要任務(wù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷的創(chuàng)新和提高，弓形蟲的基因疫苗作為可能用于預(yù)防弓形蟲病的重要方式之一，其相關(guān)研究也越來越引起人們的重視。基因疫苗具有免

2、疫保護力強、免疫持久、穩(wěn)定性好、制備簡單、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點。
　　弓形蟲的致密顆粒蛋白是由顆粒細胞器分泌的一類免疫活性蛋白，它們在弓形蟲的細胞內(nèi)生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，是重要的疫苗候選分子。有關(guān)研究表明，弓形蟲GRA17基因的缺失能夠使蟲體喪失毒力，這為我們對GRA17和GRA23基因的核酸疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究旨在構(gòu)建弓形蟲GRA17基因的DNA疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗，評

3、價其抗弓形蟲的免疫保護力。利用RT-PCR技術(shù)從RH株弓形蟲速殖子總RNA中擴增得到弓形蟲TgGRA17和TgGRA23基因，構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pVAX-GRA17和pVAX-GRA23；然后將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293-T細胞中，并對基因在細胞中的表達情況進行鑒定分析。利用重組質(zhì)粒pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組對BABL/c小鼠先后進行三次免疫，以空質(zhì)粒pVAX1作為

4、對照；在第3次免疫之后2 w和每次免疫之前收集小鼠血清，利用ELISA方法對小鼠血清中的IgG抗體水平進行檢測。在第三次免疫2w后，每組取3只小鼠，將小鼠安樂死之后取脾臟，制備脾淋巴細胞懸液；利用CCK-8法對脾淋巴細胞增殖能力進行檢測，用流式細胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞百分比。利用弓形蟲速殖子抗原（STAg）刺激小鼠脾細胞，通過ELISA檢測試劑盒對脾細胞因子進行檢測。三次免疫之后，對小鼠進行攻蟲實驗，評價基因疫苗

5、對小鼠的免疫保護力。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在Ⅰ型RH蟲株中敲除了GRA17基因，成功構(gòu)建RHΔGRA17蟲株，并利用RHΔGRA17蟲株感染昆明小鼠，分別在免疫28 d和70 d之后收集小鼠血清，利用ELISA方法對小鼠血清中的IgG抗體水平進行檢測。并在免疫70 d之后每組取三只小鼠安樂死之后取脾臟，制備脾淋巴細胞懸液，利用弓形蟲速殖子抗原刺激小鼠脾細胞，通過ELISA檢測試劑盒
　　對脾細胞因子進行檢測。在免疫70 d

6、后對小鼠進行攻蟲實驗，評價RHΔGRA17蟲株對小鼠的免疫保護力。
　　GRA17和GRA23基因疫苗實驗結(jié)果顯示，疫苗免疫組IgG抗體水平隨著時間延長而逐漸升高，且混合基因疫苗組的抗體水平高于單基因疫苗組。脾淋巴細胞增殖實驗與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示， pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23混合疫苗免疫組的SI值分別為1.24±0.13，1.54±0.11，1.57±0.085；CD

7、4+T細胞百分比分別為21.49±1.68，21.23±3.89，20.34±1.88；CD8+T細胞百分比分別為6.66±1.02，7.63±1.24，8.20±0.97。與對照組相比以上數(shù)據(jù)都有一定程度的升高。經(jīng)致死性RH株弓形蟲感染后，pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組小鼠存活時間分為9.1±0.32 d、10.8±0.79 d和12.6±2.55 d，與對照組相比均

8、有明顯增長。說明 pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，并對弓形蟲感染產(chǎn)生了一定程度的免疫保護力，且混合疫苗與單基因疫苗相比具有更好的免疫保護效果。
　　RHΔGRA17蟲株弱毒苗研究結(jié)果顯示，RHΔGRA17弱毒蟲株能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。弓形蟲急性感染試驗中，空白對照組小鼠感染弓形蟲RH、PYS和TgC7

9、蟲株后，小鼠再感染10 d之內(nèi)全部死亡；而經(jīng)RHΔGRA17蟲株免疫的小鼠能感染弓形蟲RH、PYS和TgC7株速殖子后，35 d之內(nèi)均無死亡現(xiàn)象。弓形蟲慢性感染試驗中，空白對照組感染弓形蟲PRU株包囊后，小鼠在感染35 d后僅有40％的小鼠存活，且存活小鼠的腦包囊鼠為4296±687個/只；而經(jīng)RHΔGRA17弱毒苗免疫的小鼠分別感染弓形蟲PRU株包囊后，小鼠在感染35 d之內(nèi)均無死亡現(xiàn)象，且存活小鼠的腦包囊鼠為53±15個/只。以上結(jié)