皮蠹科DNA條碼分類技術研究.pdf

1、皮蠹科（Dermestidae）隸屬鞘翅目（Coleoptera）皮蠹總科（Dermestoidea），是一類重要的儲藏物害蟲，食性雜、繁殖力強，危害嚴重。皮蠹科廣泛分布于世界各地，目前全世界已知1000多種，我國約有100余種。種類準確識別鑒定是害蟲防治的基礎，皮蠹科分類以成蟲形態(tài)研究為主，幼蟲形態(tài)相似較難區(qū)別，由于形態(tài)研究對鑒定人員的分類知識和經(jīng)驗要求較高，實際工作中種類鑒定困難較大。近年來，快速發(fā)展的分子生物學技術為昆蟲種類的快速

2、鑒定提供了新的方法，但皮蠹科昆蟲的分子生物學研究仍處于初步階段，且目前的分子研究多集中于斑皮蠹屬（Trogoderma），也未有針對皮蠹科內(nèi)相關屬之間系統(tǒng)的分子進化研究。
　　本文為首次利用DNA條形碼技術對皮蠹科倉儲害蟲進行分類研究。從DNA提取方法、PCR體系擴增進行試驗探索，構建皮蠹科分子系統(tǒng)發(fā)育關系，初步建立起皮蠹科基因條形碼數(shù)據(jù)庫，以期利用DNA條形碼技術實現(xiàn)對皮蠹科害蟲的快速分類鑒定。研究內(nèi)容及結(jié)果包括：
　　1

3、．研究皮蠹科形態(tài)分類，分析重要種類的鑒定特征，攝取各種的背、腹、側(cè)面高清圖輔助鑒定。
　　2．優(yōu)化DNA提取方法，探索了不同預處理方法對DNA提取效果的影響。經(jīng)過預處理后，一定程度上減少了基因組DNA的斷鏈，DNA更易擴增長片段，且不同位點擴增效果也較好，其中以9％NaCl溶液3h預處理后的昆蟲標本，利用磁珠法所提DNA的質(zhì)量及PCR擴增效果最佳。
　　3．建立適宜的PCR擴增體系。反應體系中加入牛血清蛋白并增加 Mg2+濃

4、度，能提高PCR擴增效率及條帶質(zhì)量。設計的4對外圍巢式引物以A5/A6擴增效果最優(yōu)，最佳退火溫度為49℃?；谛蛄蟹治鼋⒌?對巢式PCR組合，均能適用于較低濃度DNA擴增。
　　4．COⅠ基因（細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因）序列分析。所獲皮蠹科COⅠ基因擴增序列為前端357bp及后端609bp片段，分別進行拼接校正、比對，利用MEGA分析了各序列保守位點、變異位點、簡約信息位點、自裔位點、各數(shù)據(jù)組堿基組成、堿基頻率、氨基酸組成、密

5、碼子使用情況，計算各物種間的遺傳距離及標準差，轉(zhuǎn)換與顛換比例。并對序列數(shù)據(jù)組系統(tǒng)發(fā)育信號進行檢測，證實序列非隨機數(shù)據(jù)，可為下一步構建系統(tǒng)發(fā)育樹提供依據(jù)保證。
　　5．系統(tǒng)發(fā)育研究。采用最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）兩種建樹方法，對皮蠹科COⅠ前、后兩端序列組及其翻譯的氨基酸進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。皮蠹科COⅠ基因后端序列片段所包含遺傳信息更豐富，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹較少發(fā)生偏離，同形態(tài)分類的一致性高于前端片段，更適于作為皮蠹