雞傳染性法氏囊病病毒非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和5′非編碼區(qū)缺失病毒突變體構(gòu)建及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、為了研究超強(qiáng)毒株毒力增強(qiáng)的原因是否與非編碼區(qū)有關(guān),在基因特異性的上游引物引入T7 RNA聚合酶啟動子序列和EcoRI酶切位點(diǎn),下游引物引入XbaI（A節(jié)段）和BamHI(B節(jié)段）酶切位點(diǎn),采用雙融合PCR方法將超強(qiáng)毒株的非編碼區(qū)和編碼區(qū)正確拼接,并分別克隆到pUC18質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)上.通過酶切和末端序列分析鑒定重組質(zhì)粒,獲得了全基因組cDNA克隆pUC18-HA和pUC18-HB,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了3個(gè)A節(jié)段5′非編碼區(qū)缺失的突變體pU

2、C18-HAΔ35、pUC18-HAΔ74、pUC18-HAΔ94和1個(gè)嵌合體pUC18-C5′/HA的侵染性克隆.為進(jìn)一步通過反轉(zhuǎn)錄遺傳體系來研究5′非編碼區(qū)對病毒復(fù)制和細(xì)胞凋亡的影響奠定了基礎(chǔ).將超強(qiáng)毒株Harbin-1A節(jié)段及其5′非編碼區(qū)缺失突變體和嵌合體cDNA克隆用XbaI線性化,B節(jié)段cDNA克隆用SmaI線性化,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,分別獲得了各自的cRNA.A節(jié)段及其5′非編碼區(qū)缺失突變體和嵌合體的cDNA分別與B節(jié)段cDNA

3、共轉(zhuǎn)染法氏囊原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞,2天后收毒.轉(zhuǎn)染上清經(jīng)4次傳代,用免疫熒光法檢測病毒抗原,結(jié)果在法氏囊原代細(xì)胞上檢測到了重組病毒（rIBDV）,而在Vero細(xì)胞上未能檢測到病毒抗原.以重組病毒為材料進(jìn)行病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究,以熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測,發(fā)現(xiàn)重組病毒均能誘導(dǎo)法氏囊原代細(xì)胞發(fā)生凋亡,但不同的病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力不同.5′非編碼區(qū)缺失病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯低于野生型病毒,5′NCR的突變可能是影響RNA的穩(wěn)定性、RN