河套蜜瓜高效再生和轉化體系建立及Rs-AFP2（R39）基因的導入.pdf

1、河套蜜瓜是內蒙古西部地區(qū)的名優(yōu)特產,目前正在進行產業(yè)化開發(fā),但每年因病害的嚴重發(fā)生而造成重大損失.傳統(tǒng)的噴施農藥和常規(guī)育種技術,均未能解決這一嚴重的問題.隨著生物技術的發(fā)展,植物抗病基因工程手段給河套蜜瓜抗病育種帶來了新的契機.Rs-AFP2(Raphanus Sativus L. antifungal-protein2是從蘿卜種子中分離到的一種抗真菌蛋白.它分子量小、穩(wěn)定性強、生物能耗低、抗菌譜較寬、抗菌活性很強,且不易使病原菌產生抗

2、性;它是植物防御體系中重要的組成部分.在國外Rs-AFP2基因已經被克隆并導入煙草等植物,表達了很高的抗真菌活性.當將Rs-AFP2的V39換成R39后,Rs-AFP2(R39)的抗真菌活性還可進一步提高.該研究對Rs-AFP2基因進行改造設計,進而合成了Rs-AFP2(R39)基因序列.在此基礎上建立了以pC18為克隆載體、pBin438為植物表達載體、根癌農桿菌LBA4404為介導載體的河套蜜瓜遺傳轉化體系.同時建立了河套蜜瓜高效再

3、生組織培養(yǎng)體系.進而將Rs-AFP2(R39)基因導入河套蜜瓜基因組,獲得了抗白粉病能力有所提高的轉基因植株.河套蜜瓜高效再生體系研究部分.通過直接不定芽發(fā)生途徑建立高效再生體系.試驗對組織培養(yǎng)主要影響因子進行研究和優(yōu)化,結果如下:子葉外植體最佳日齡為4日齡;外植體最佳取樣部位為子葉近軸端1/3切段;接種方式為子葉切塊遠軸面接觸培養(yǎng)基;再生芽分化培養(yǎng)基為MS附加6-BA0.9mg/L;再生芽伸長培養(yǎng)基為MS附加6-BA0.3mg/L;再

4、生芽生根培養(yǎng)基為MS附加IAA1.5mg/L.以此優(yōu)化體系對河套蜜瓜進行再生培養(yǎng),外植體再生率達到85﹪以上,單個外植體萌發(fā)伸長芽數達到8個以上,再生芽生根成苗率達到95﹪以上.形態(tài)學和組織解剖學觀察結果表明,該研究獲得的再生芽屬于直接發(fā)生型;子葉外植體上再生芽發(fā)生部位具有明顯的極性現(xiàn)象;這種極性現(xiàn)象的發(fā)生與子葉內組織結構的不對稱性和維管束對營養(yǎng)的極性運輸有關.該研究還成功誘導出直接發(fā)生和間接發(fā)生兩種類型的體細胞胚,進而獲得了再生植株.

5、對體胚再生培養(yǎng)的幾個關鍵影響因子的研究結果如下:體胚誘導培養(yǎng)基以MS附加2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L為最佳濃度配比.體胚誘導培養(yǎng)期內,先進行2周黑暗培養(yǎng)再進行1周見光培養(yǎng)效果較好.培養(yǎng)基糖源濃度以60g/L較適合體細胞胚的發(fā)生和發(fā)育.解剖學觀察結果表明,該研究獲得的體細胞胚為單細胞起源,分化進程與合子胚相似.但不同外植體、同一外植體不同部位體細胞胚分化進程存在著明顯的不一致性.目的基因合成和載體構建部分.參照Rs-A

6、FP2 cDNA序列和前人經驗,設計改造Rs-AFP2基因;以PCR擴增二次延伸法合成了Rs-AFP2(R39)基因全序列,并將該基因片段插入到pUC18之上,構建了pUAFP2(R39)克隆載體.然后通過二次連接法將Rs-AFP2(R39)基因片段與pBin438連接環(huán)化.構建了植物雙元表達載體pBinAFP2(R39).最后再通過三親雜交方法,將pBinAFP2(R39)質粒轉入介導載體根癌農桿菌LBA4404菌株之中.河套蜜瓜遺傳

7、轉化及轉化子篩選鑒定部分.用攜帶有pBinAFP2(R39)質粒的根癌農桿菌LBA4404轉化河套蜜瓜,試驗對幾個影響轉化的重要因素進行了優(yōu)化.結果如下:轉化受體子葉的最佳日齡為4日,最佳共培養(yǎng)時間為4日,轉化子篩選培養(yǎng)基Kan適合濃度為75mg/L.該研究獲得一批Kanr植株,經PCR檢測,有兩株為陽性.對一株的特征譜帶進行回收測序,結果表明,Rs-AFP2(R39)基因已經整合到河套蜜瓜的基因組中.進一步在溫室內進行白粉病抗性鑒定,