PHA基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、為了解決化工合成塑料對(duì)環(huán)境造成污染這一難題,開發(fā)和利用生物可降解塑料日益受到人們的重視.聚羥基烷酸(polyhydrocylkanotes PHAs)作為一種大的聚合物,既是許多種細(xì)菌的碳源貯存形式,又是一種生物可降解塑料的原料,利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)PHA是當(dāng)前生產(chǎn)生物可降解塑料研究的熱點(diǎn).該課題組從合成PHA的pseudomanas sp.菌株的亞克隆基因組片段中,分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段,定向克隆至原核表達(dá)載

2、體pBV220,通過(guò)對(duì)其生物活性與功能分析,確證了基因phaA、phaB和phaC的生物學(xué)功能;為了通過(guò)植物生物反應(yīng)器對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)一步研究利用,該實(shí)驗(yàn)利用這三個(gè)基因構(gòu)建了兩組可用于不同植物生產(chǎn)PHA的真核表達(dá)載體,并對(duì)紫葉酢漿草進(jìn)行PHA基因遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究,獲得主要結(jié)果如下:1.利用克隆的phaA、phaB、phaC三個(gè)基因分別構(gòu)建了可用于轉(zhuǎn)化紫葉酢漿草表達(dá)載體pBI121-A、pBI121-B、uBquiting-C;可用于玉米

3、轉(zhuǎn)化的種子特異性表達(dá)載體p7S-A、pBI121-S-B、uBquiting-C.經(jīng)酶切分析、PCR擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證所構(gòu)建的表達(dá)載體是正確的.2.通過(guò)對(duì)紫葉酢漿草組織培養(yǎng)的研究,初步建立了紫葉酢漿草的再生體系.篩選出誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.1 mg/L;分化的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.9 mg/L+6-BA 0.4 mg/L;生根培養(yǎng)基為MS+2,4-D 0.5 mg/L;愈傷組織Kan抗

4、性篩選的最佳濃度為58 mg/L.3.利用基因槍對(duì)紫葉酢漿草愈傷組織進(jìn)行了PHA基因表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)Kan抗性篩選獲得了96株抗性小苗,經(jīng)PCR檢測(cè),其陽(yáng)性植株率為1.57％.在7株中phaA、phaB單價(jià)轉(zhuǎn)化的分別為一株;含有phaA和phaB基因共轉(zhuǎn)化一株;含有phaA和phaC基因共轉(zhuǎn)化一株;含有phaB和phaC基因共轉(zhuǎn)化兩株;含有phaA和phaB和phaC三個(gè)基因共轉(zhuǎn)化一株.其轉(zhuǎn)基因株進(jìn)一步確證快繁擴(kuò)增、遺傳穩(wěn)定性和