13934.嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達載體的構建、轉染及鑒定

1、分類號Q812學校代碼10129UDC57.08學號2010211011嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達載體的構建、轉染及鑒定StudyonConstructionTransfectionofMammaryGlSpecificExpressionVectfSsβgly申請人：杜威學科門類：理學學科專業(yè)：發(fā)育生物學研究方向：動物遺傳與發(fā)育指導教師：周歡敏教授論文提交日期：二〇一三年六月摘要利用牛乳腺生物反應器產生乳糖分解酶從而生產低乳糖牛

2、奶，是解決乳糖不耐癥的一種手段，而構建高效、特異的表達載體是制備乳腺生物反應器的關鍵步驟。本實驗將來源于古細菌的嗜熱菌β糖苷酶基因（LacS）根據牛的密碼子使用頻率進行了密碼子優(yōu)化，并合成了優(yōu)化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游調控區(qū)域做為啟動子，以嗜熱菌β糖苷酶（LacS）為目的基因，添加了Loxp錨定的新霉素抗性基因（Neo）和增強型綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)，構建了pLOXEGFPBLGLacS載體。并且通過脂質體介導方法

3、將重組質粒轉染小鼠的乳腺癌細胞，并篩選得到單克隆。陽性單克隆通過PCR進行DNA水平的整合檢測；經催乳素誘導后的陽性單克隆通過RTPCR進行mRNA水平表達檢測。研究結果如下：首先乳腺特異表達載體的構建。通過PCR技術擴增出924bp牛β乳球蛋白（BLG）基因5調控序列，并與T載體連接記為pMD19BLG，質粒大小為3.7kb。然后將其與公司優(yōu)化合成的pUC57LacS質粒，pLOXEGFP質粒通過相應的酶切后進行連接，經基因重組后構建

4、了乳腺特異性表達載體pLOXEGFPBLGLacS。使牛β乳球蛋白基因5端調控序列啟動嗜熱菌糖苷酶基因在乳腺中特異表達，而新霉素抗性基因和EGFP的表達，便于篩選陽性克隆。其次，乳腺特異性表達載體轉染小鼠乳腺癌細胞。37℃水浴解凍小鼠乳腺癌細胞，并進行G418最小致死濃度測定然后通過脂質體介導重構載體轉染小鼠乳腺癌細胞，并通過PCR和RTPCR的方法進行重構載體的整合檢測和表達檢測。結果表明，小鼠乳腺癌細胞G418最小致死濃度為700μ