玉米和黑麥草漆酶基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析及玉米水分脅迫下基因表達(dá)研究.pdf

1、本研究利用基因同源序列克隆技術(shù)、cDNA-AFLP技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，一方面，進(jìn)行黑麥草和玉米漆酶基因的克隆與分析；另一方面，對(duì)水分脅迫條件下4個(gè)玉米自交系材料的基因表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，確定與玉米抗旱相關(guān)的功能基因，從而為遺傳工程改良飼料作物的消化率和增強(qiáng)玉米種質(zhì)的抗旱性提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。這對(duì)于我國農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和畜牧業(yè)的發(fā)展以及實(shí)施高效節(jié)水農(nóng)業(yè)均具有一定的理論和實(shí)踐意義。 通過對(duì)參與木質(zhì)素合成途徑中一個(gè)重要酶

2、-漆酶的系統(tǒng)分析與克隆以及利用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)不同抗旱性的玉米種質(zhì)在水分脅迫條件下的基因表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究，獲得了以下主要結(jié)果： 1.以64個(gè)不同來源的植物漆酶為材料，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了比較分析，并進(jìn)行了分子進(jìn)化機(jī)制的探討。發(fā)現(xiàn)漆酶作為藍(lán)銅氧化酶蛋白家族的成員，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)不等的保守區(qū)域(HWHG和HLHG)及N糖基化結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系表明，植物漆酶是一個(gè)高度趨異的多基因家族，在種子植物分化為被子植物和裸子植物的

3、前后，均可能發(fā)生了基因復(fù)制； 2.進(jìn)一步通過對(duì)64個(gè)漆酶的一系列特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：同一物種的不同漆酶成員在序列上差異很大；在單子葉和雙子葉植物中均有細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)漆酶蛋白；糖基化位點(diǎn)數(shù)目(8-23個(gè))和等電點(diǎn)值的變化范圍都很大(5-10)；漆酶的催化底物廣泛；在不同組織中差異表達(dá)。因此，植物漆酶除了參與木質(zhì)素的生物合成外，還可能具有其它功能； 3.在27個(gè)水稻漆酶基因中，有9個(gè)位于第9號(hào)染色體上，6個(gè)位于第11號(hào)染色體上

4、。這就意味著超過一半的漆酶成員集中在2條染色體上。水稻第1號(hào)染色體上的漆酶基因分散在3個(gè)不同的區(qū)段，從GRLC26到GRLC1跨越了21Mb。GRLC26位于區(qū)段1(15371897-15374072bp)；GRLC6位于區(qū)段2(25214631-25216628bp)。區(qū)段3為GRLC5和GRLC1之間(1.3Mb)，該區(qū)域位于C126435和C15960標(biāo)記之間。位于第11號(hào)染色體上的漆酶基因，聚集于3個(gè)區(qū)段。其中，GRLC8、GR

5、LC11、GRLC12、GRLC15位于短臂末端。我們發(fā)現(xiàn)GRLC11、GRLC12和GRLC15與水稻的一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆在染色體上的位置相近。17個(gè)擬南芥漆酶基因只有AtLC1和AtLC7分布于第1、4號(hào)染色體，其余則密集分布于第2、5號(hào)染色體。依據(jù)已經(jīng)發(fā)表的擬南芥基因組部分復(fù)制區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)在第3號(hào)染色體的AtLC7和第5號(hào)染色體的AtLC8、AtLC9、AtLC10、AtLC11和AtLC12之間發(fā)生了基因復(fù)制；

6、 4.擬南芥16個(gè)漆酶基因的數(shù)字化Northern分析結(jié)果顯示，多數(shù)基因在根和莖組織強(qiáng)烈表達(dá)。AtLC2和AtLC17在不同組織的表達(dá)模式基本相同，二者在莖組織顯著表達(dá)，而且它們的序列非常相似。AtLC7和AtLC8也具有相似的情況，二者在根部均強(qiáng)烈表達(dá)，而且其序列的同源性也很高，在分子進(jìn)化關(guān)系圖譜中同屬于一個(gè)類群； 5.以一個(gè)黑麥草作圖群體的兩個(gè)親本F＃30和F＃39的基因組DNA為模板，利用5對(duì)黑麥草特異引物，進(jìn)行漆酶基因

7、克隆。最終得到3個(gè)黑麥草漆酶基因片段Lac10-1、Lac10-1、Lac11-2。同源搜索發(fā)現(xiàn)，它們與已經(jīng)克隆的植物漆酶具有較高的同源性，并且含有保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)([HWH]和[HAH])； 6.設(shè)計(jì)了21對(duì)用于玉米漆酶基因克隆的特異引物，并在此基礎(chǔ)上利用KWS公司的8個(gè)玉米自交系材料，克隆了168個(gè)漆酶基因片段；以M13進(jìn)行正、反向測序(336個(gè)反應(yīng))，共得到有效序列81個(gè)。對(duì)其中一組cDNA克隆的氨基酸序列進(jìn)行分析，找

8、到一個(gè)屬于多銅氧化酶基因家族的COG2132，SufI保守域； 7.將玉米漆酶基因ZmP7定位到H21×Mo17作圖群體的第4號(hào)染色體短臂的nc004(Bin4.03)和phi026(Bin4.05)標(biāo)記之間； 8.利用cDNA-AFLP技術(shù)檢測到水分脅迫條件下，差異表達(dá)條帶近500條，回收cDNA帶380條，最終得到有效序列42個(gè)；GeneBank數(shù)據(jù)庫中搜索發(fā)現(xiàn)：1個(gè)cDNA沒有相匹配的序列；2個(gè)片段的同源序列為功能

9、未知的蛋白；15個(gè)cDNA的同源序列均為功能未知的玉米克??；4個(gè)cDNA的同源序列為功能未知的水稻克隆。在所剩余的20個(gè)功能已知的cDNA片段中，既有與干旱脅迫相關(guān)的重要功能蛋白((牛龍)牛兒酰(牛龍)牛兒基還原酶、3-磷酸脫氫酶、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、丙糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、也有一些重要的轉(zhuǎn)錄因子(蛋白激酶C、GTP結(jié)合蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鋅指蛋白、MYB)等； 9.在所克隆的一個(gè)玉米漆酶基因片段ZmP7-AS30的啟動(dòng)子區(qū)域