甜菜夜蛾幾丁質合成酶的表達及初步純化.pdf

1、　　本文以目前重要的農業(yè)害蟲——甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)為研究對象，根據已克隆的甜菜夜蛾幾丁質合成酶全長序列，選擇其中保守的催化域片段進行克隆表達。首先根據已知序列設計-對特異性引物，引物序列如下：up--TGTGGATCCCACAGTGACGATGATTCTCAG(下劃線部分為BamHI酶切位點)，Down--TGCAAGCTTTTGATACCACACCATAGGGC(下劃線部分為HindⅢ酶切位點).以實驗室存有

2、的克隆到PMD-18T載體上的甜菜夜蛾幾丁質合成酶催化域片斷(PMD-SeCHS)為模板，進行PCR擴增，將得到的目的大小的片段進行割膠回收，然后進行BamHI和HindⅢ雙酶切，將得到的帶有粘性末端的片段與經過BamHI和HindⅢ雙酶切的pQE30表達質粒進行體外連接，轉入大腸桿菌TG1中，篩選菌，提質粒，酶切鑒定后，將其轉入大腸桿菌M15中測序鑒定。測序正確的菌液保存，并用IPTG誘導使其表達。結果表明甜菜夜蛾幾丁質合成酶片段基因

3、已成功表達。在體外表達了甜菜夜蛾幾丁質合成酶催化域片段的基礎上，還根據pQE30載體本身帶有6-His標簽，它能將目的蛋白與6個組氨酸進行融合表達，而Ni-NTA(鎳一次氨基三乙酸)樹脂對含有六個連續(xù)的組氨酸殘基的親和標簽-六組氨酸標簽(6-Histag)的蛋白的高度選擇性，將目的蛋白進行純化，結果目的蛋白的純度增加了，可還是有少量的非目的帶的出現(xiàn)。但是足以證明了所表達的目的蛋白含有6-His標簽，而且可以用來進行酶的活性等的研究。本論