ICOS-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植急、慢性排斥反應中作用研究.pdf

1、背景：臨床上同種異體排斥反應仍然是器官移植的主要障礙，器官移植患者幾乎無一例外地要長期、正規(guī)地應用免疫抑制劑。同種異體排斥反應的實質(zhì)是T細胞活化，經(jīng)典移植免疫學理論認為，T淋巴細胞的活化需要兩個信號。信號1為抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells，APC)表面的主要組織相容性抗原／外源性抗原復合物(MHC／Ag complex)，與T細胞表面的T細胞受體／CD3復合物(TCR／CD3 complex)相結合；信號

2、2為APC或B細胞表面的共刺激抗原分子與其配體的相結合(共刺激通路)。在共刺激通路中，起主要作用的是B7-CD28／CTLA4和CD40-CD154信號途徑。CTLA4在T細胞活化后迅速上調(diào)表達，并對T細胞起負性調(diào)節(jié)作用。研究表明，如果缺乏共刺激信號，TCR介導的抗原信號刺激會導致T細胞無能，T細胞無法分泌IL-2即T細胞無法進入活化、增殖階段。 盡管大量的證據(jù)表明，CD28分子在啟動T細胞免疫反應中提供了關鍵的共刺激信號，然而

3、并非所有情況下T細胞活化都依賴于B7-CD28信號。研究表明，CD28<-/->小鼠仍能對同種異體移植皮膚發(fā)生排斥反應。阻斷CD40-CD154交聯(lián)也不能完全抑制同種異體小鼠心臟移植排斥反應。近年來研究表明，CD8<'+>T細胞不依賴CD28或CD154提供的共刺激信號仍可以繼續(xù)得以活化，說明在T細胞的活化中還可能存在其他共刺激分子或共刺激信號途徑。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，B7／CD28家族其他成員也參與調(diào)節(jié)細胞和體液免疫反應?？烧T導

4、共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)是B7／CD28家族新成員，盡管ICOS分子與CD28和CTLA4分子在結構上具有同源性(在大鼠，ICOS與CD28和CTLA4分別具有19％和13％相同的氨基酸序列)，但不同于CD28分子，ICOS分子并不在T細胞表面持續(xù)表達，僅表達于活化T細胞表面，其作用機制也不相同，并不能與CD28和CTLA4的配體結合。B7家族新成員B7h，B7RP-1，GL50或ICOSL為

5、ICOS分子的配體。ICOS分子可能加強T細胞對外來抗原的反應，包括細胞增殖、淋巴因子的分泌，細胞間粘附分子的上調(diào)、加強B細胞產(chǎn)生抗體和維持或調(diào)節(jié)記憶性T細胞的功能。ICOS信號通路可增強鼠和人類T細胞的增殖，促進IL-10的產(chǎn)生，而且CD28共刺激信號可加強ICOS分子的表達，從而調(diào)節(jié)T細胞的分化。Coyle等認為ICOS分子是活化T細胞的一個重要受體，使T細胞向Th2而不是向Th1效應細胞分化。因此，抑制ICOS分子能有效的抑制活化

6、T輔助細胞功能，從而抑制IL-4和INF-γ的分泌。盡管CD28／B7對免疫反應的啟動具用重要作用，而ICOS分子與其配體結合在后期免疫反應和二次免疫反應中占主要作用。ICOS分子也是一個重要的粘附分子，其粘附一支持能力與CD28相比有顯著差別，ICOS分子可引起強烈的細胞間粘附。這暗示ICOS分子在構建"免疫突觸"中發(fā)揮重要的作用。 本研究應用大鼠腹腔內(nèi)異位心臟移植模型,通過應用病理學、RT-PCR,EUSA、免疫組化、免疫熒

7、光流式細胞技術等實驗技術手段,探索ICOS分子途徑在同種異體移植物排斥反應中的表達情況及意義。同時探索抑制ICOS-B7RP-1共刺激通路對大鼠同種異體心臟移植急性和慢性排斥的影響及其可能的機制。 第一章大鼠腹腔異位心臟移植模型的建立 目的：建立簡便易行的大鼠腹腔異位心臟移植模型,總結制作大鼠腹腔異位心臟移植模型的體會。 方法：低溫灌注后切取供體心臟,分離出受體腎動脈平面以下的下腔靜脈和腹主動脈,將供心主動脈與受

8、體腹主動脈端側吻合,供心肺動脈與受體下腔靜脈端側吻合。術后觀察移植心的存活情況,移植心心跳停止后,切取移植心,病理學檢查確定排斥情況。 結果：通過2個月的手術訓練,成功建立了穩(wěn)定的大鼠腹腔異位心臟移植模型。供心缺血時間35±7分鐘,手術成功率82[％]。 結論：手術成功的關鍵:①麻醉及肝素化劑量合適;②供心的灌注及保護,縮短供心缺血時間;③提高血管吻合質(zhì)量和速度,減少出血;④術后保溫,及時補充液體。 第二章ICO

9、S-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植急性排斥反應中作用研究 目的：研究ICOS分子在大鼠同種異體心臟移植模型中的組織表達以及阻斷ICOS-B7RP-1通路對移植心的保護作用。 方法：建立大鼠異位腹腔心臟移植模型,設同基因移植組、以未處理和無關抗體干預大鼠為對照組和抗.-ICOS治療大鼠為實驗組。術后取出移植心臟行組織病理學檢查,移植心臟內(nèi)ICOS分子的表達(免疫組化),ICOS、B7RP-1、IL-2、IL-

10、4、IL-10、INF-γmRNA表達的測定[逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法],CD4<'+>與CD8<'+>T淋巴細胞浸潤(免疫熒光抗體法)檢查,同時檢測外周血IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ細胞因子水平變化[酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法]和脾臟淋巴細胞CD25和ICOS表達[流式細胞測定技術(FACS)],余下的動物觀察移植心臟存活時間。 結果：(1)同基因移植組大鼠及移植心均獲得長期存活(>100d),實驗

11、組移植心臟存活時間(16.5±1.51)d,其他對照組分別為(6.86±1.35)d、(6.63±1.06)d(P<0.05);(2)同基因移植組各個時間段移植心病理學檢查均未發(fā)現(xiàn)排斥現(xiàn)象，實驗組與對照組比較，術后3、5、7天心肌淋巴細胞浸潤程度明顯減輕，實驗組術后5天急性排斥反應為2級，而對照組均為3A～4級；(3)實驗組移植物內(nèi)ICOS、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ mRNA表達明顯下調(diào)(術后5天)，而其他對照組顯著上

12、調(diào)，實驗組外周血IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ高峰延遲；(4)實驗組術后第5天移植物內(nèi)CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細胞浸潤明顯減少，ICOS分子的表達幾乎完全受抑制，與其他對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(6)實驗組術后第7天受體脾臟CD4和CD8細胞表面CD25和ICOS表達明顯減低(P<0.05)。結論 阻斷ICOS-B7RP-1共刺激信號通路可以保護同種異體移植心臟，推遲和減輕移植心臟急性排斥反應

13、的發(fā)生，延長移植心臟的生存時間。 第三章I COS-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植慢性排斥反應中作用研究 目的：研究阻斷ICOS-B7RP-1共刺激通路對慢性排斥反應(CR)的抑制作用，并探討其可能的作用機制。 方法：建立大鼠異位腹腔心臟移植模型，將實驗動物分為四組：A組：同基因移植組；B組：同種異體移植組(急性排斥組)，未給予任何治療；C組：慢性排斥組，CsA 10.0 mg·kg<'-1>灌胃，

14、連續(xù)60天；D組：實驗組，CsA10.0 mg.kg<'-1>.d<'-1>灌胃，連續(xù)60天，同時抗-ICOS單抗2mg／kg腹腔注射，2次／周腹腔注射至術后60天。觀察移植心臟存活天數(shù)，術后5天和移植心存活超過100天時分別取移植心和受體脾臟檢測ICOS表達，移植心存活超過100天時進行組織學檢查并檢測其受體外周血CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞比例。 結果：(1)A組大鼠及移植心均獲得長期存活(>100)d，B、C

15、、D組大鼠移植心臟存活時間分別為(6.86±1.35)d、(93.75±6.13)d和(>100)d，與B組相比，治療組大鼠心臟存活時間明顯延長，差異有顯著性意義(P<0.05)，D組與C組相比有顯著性差異(P<0.05)；(2)術后第5天D組與B組、C組比較其移植心和受體脾臟內(nèi)ICOS表達明顯減低，而B組與C組比較，其移植心臟內(nèi)ICOS表達明顯降低，而受體脾臟內(nèi)ICOS表達明顯無顯著變化，術后100天D組與C組比較，其移植心臟和受體脾

16、臟內(nèi)ICOS表達均明顯降低；(3)術后100天A組各個時間段移植心病理學檢查均未發(fā)現(xiàn)排斥現(xiàn)象，僅見少許心肌纖維化，D組與C組相比，移植心慢性排斥損傷明顯減輕，而且3／7未見明顯的慢性排斥損傷，其血管內(nèi)膜炎、血管狹窄評分顯著低于C組(P<0.05)；(4)D組與C組相比外周血CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯升高(P<0.05)。 結論：阻斷ICOS-B7RP-1共刺激通路具有明顯的抗移植物慢性排斥損傷作用，其作用