小鼠胚胎干細胞向肝前體細胞誘導分化及其對實驗性急性肝衰竭的移植治療研究.pdf

1、目的 1.建立小鼠ES細胞的體外培養(yǎng)方法，并將GFP(Greenfluorescenceprotein，GFP)基因轉染到ES細胞，通過熒光顯微成像技術可以對ES細胞進行示蹤作用，并觀察ES細胞的生長培養(yǎng)特性、形態(tài)學、生物學及其超微結構。 2.小鼠ES細胞的體外培養(yǎng)誘導分化為HPCs的條件建立及其優(yōu)化。 3.小鼠ES細胞的體外培養(yǎng)誘導為HPCs的分子生物學鑒定，并初步探討ES細胞誘導為HPCs的分子機制。

2、 4.將體外培養(yǎng)誘導的18dHPCs移植并整合到移植受體小鼠肝脾組織的實驗研究，檢測移植細胞的功能。 5.將體外培養(yǎng)誘導的18dHPCs用于治療小鼠急性肝衰竭模型的實驗研究。 方法 1.小鼠ES細胞的培養(yǎng)：首先制備MEF(mouseembryonicfibroblast，MEF)，應用絲裂霉素C(mitomycinC，mitoC)處理MEF細胞1h后，將ES細胞培養(yǎng)在MEF細胞上，并將GFP基因轉染到ES細胞中。

3、應用免疫組化檢測ES細胞堿性磷酸酶(alklinephosphatase，ALP)，用透射電鏡觀察ES細胞超微結構。 2.比較懸滴培養(yǎng)技術與懸浮培養(yǎng)技術制備擬胚體(embryoidbodies，EBs)效果、EBs直接貼壁誘導與EBs分散成單細胞誘導、有血清誘導法與無血清誘導法，不同包被介質對EBs貼壁率的影響以及不同誘導因子的選擇對肝前體細胞誘導的影響等。觀察EBs的生長特性、分化的HPCs特點，探討ES細胞誘導分化為HPCs

4、的最佳條件。 3.按照所確定的優(yōu)化條件從ES細胞誘導出18dHPCs在電鏡下觀察細胞的形態(tài)結構特征；免疫組化染色檢測CK18、CK19，測定HPCs產生白蛋白能力、合成尿素與糖能力、PAS反應以及細胞線粒體能量代謝關鍵酶COX、SDH，利用RT-PCR測定ES細胞及其向HPCs分化過程中ALB、AFP、G-6-P、GATA4、OCT4、HNF3α、HNF4α的表達情況。 4.將從ES細胞誘導出的18dHPCs用熒光染料H

5、ochest3342標記；小鼠移植受體采用2-AAF(2-acetylaminofluorene，2-AAF)處理2周、經(jīng)7Gy60Co進行亞致死劑量輻照，并在移植前進行肝臟50％PHx；將標記好的HPCs通過小鼠尾靜脈、肝門靜脈以及直接穿刺移植方式移植到受體小鼠肝臟、脾臟組織，移植4周后檢測移植細胞在肝脾組織的功能與生長情況。 5.利用D-半乳糖胺一次性腹腔內注射致敏，然后將LPS(內毒素)通過小鼠腹腔注射誘導小鼠急性肝衰竭模

6、型，根據(jù)小鼠死亡率、肝臟病理及肝功能損傷程度選擇小鼠ALF的最適D-半乳糖胺/LPS誘導劑量。移植受體模型制備后6h，從小鼠尾靜脈直接穿刺移植6.0×106細胞(細胞懸液中細胞濃度為6×107細胞/ml)；對照組和模型組亦從小鼠尾靜脈注射PBS以作對照。在HPCs移植后1d、3d、7d，檢測對照組、模型組、治療組肝功能指標ALT、AST、ALP、ALB和TBil，測定血漿凝血酶原時間(PT)；同時留取相應時相點動物肝臟組織進行冰凍切片作

7、病理學觀察。 實驗結果 1.ES細胞在1Oμg/mlmitoC處理1h后的MEF細胞上生長旺盛，ES細胞克隆成梭行、圓形或橢圓形狀生長，ES細胞克隆周邊與MEF細胞邊緣清楚。轉染上了GFP基因的ES細胞在倒置熒光顯微鏡下能發(fā)出綠色熒光。培養(yǎng)的ES細胞克隆ALP染色陽性，并且在電鏡下ES細胞核大，核形不規(guī)則，核仁大且多，細胞器少，胞體表面微絨毛較少，具有原始幼稚細胞特點。 2.制備EBs細胞采用懸浮培養(yǎng)技術與懸滴培

8、養(yǎng)技術相結合的效果最好。在誘導分化中，EBs在0.03％Ⅰ型膠原蛋白、1％Matrigel、0.3％明膠包被介質上貼壁較好；有血清誘導法較無血清誘導法細胞生長較好；EBs分散成單細胞誘導的HPCsALB陽性率較高可達到56.7％。在HPCs誘導因子的選擇中加入EGF、Acid-FGF、HGF等細胞因子的誘導效果最好。 3.按照所確定的優(yōu)化條件所誘導分化的18dHPCs在電鏡下常見雙核細胞，細胞表面有許多類似肝細胞表面的微絨毛，細

9、胞內細胞器豐富，可見線粒體、內織網(wǎng)、高爾基體、糖顆粒以及脂肪顆粒或空泡狀結構，常見由兩個以上細胞圍成的腔隙樣結構。誘導的HPCs在15d～18d分泌白蛋白較高；18dHPCs具有合成糖、尿素氮能力，但低于胎肝細胞的糖與尿素氮合成能力；18dHPCs可見CK18、CK19陽性細胞，PAS反應陽性。18dHPCs線粒體能量代謝的關鍵酶COX、SDH的染色陽性，但其強度明顯低于胎肝細胞；RT-PCR實驗也表明HPCs在誘導晚期能表達ALB、A

10、FP、G-6-P基因。這些實驗結果表明，18dHPCs已經(jīng)開始具有一定的肝細胞功能。在HPCs的誘導分化過程中，GATA4和OCT4的表達在ES細胞開始誘導過程中逐漸減弱，6d后基本檢測不到，而HNF3α、HNF4α則相反，HNF3α在誘導過程的第6d開始檢測到，HNF4α在開始誘導的第9d開始檢測到，這些肝細胞核因子均與HPCs誘導分化過程密切相關。 4.通過尾靜脈注射移植、肝脾直接注射移植以及肝門靜脈移植18dHPCs4周后

11、檢測表明，HPCs能夠遷移到肝脾組織整合生長，移植細胞能產生白蛋白，小鼠肝脾均未見腫瘤組織或者畸胎瘤生成。另外，通過肝門靜脈移植后，有少許HPCs還遷移到脾臟組織整合生長。實驗結果表明，我們所誘導的18dHPCs可用作肝細胞移植材料。 5.根據(jù)小鼠存活率、肝臟病理變化及肝功能的損害指標，我們選擇每只小鼠注射800mgD-半乳糖胺/20μgLPS/Kg體重劑量。在小鼠ALF模型組，D-半乳糖胺/LPS誘導后第1d，ALT、AST、

12、ALP、TBil、PT指標開始顯著升高，第3d肝功能受損處于高峰，第7d明顯回落。模型組與治療組相比較，在第1d除PT有顯著改變外(P＜0.05)，其余指標無顯著改變；在第3d除ALB外，其它指標均有顯著改變(P＜0.01)；在第7d除AST、ALB外，ALT、ALP(p＜0.05)，T.Bil、PT(P＜0.01)均有顯著改變。實驗結果表明HPC移植能改善ALF的肝功能。 結論 1.建立了體外小鼠ES細胞培養(yǎng)技術，并將

13、GFP基因成功轉入ES細胞作為示蹤作用；對ES細胞的生長特性、生物學特性及其超微結構進行了觀察。ES細胞在MEF細胞和含1000U/mlLIF的培養(yǎng)介質中容易培養(yǎng)成功，細胞增殖旺盛，并且能夠保持ES細胞特性，可以作為種子細胞來源，為ES細胞的誘導分化和組織工程重建等后續(xù)研究打下基礎。 2.建立起了將ES細胞誘導為肝前體細胞的優(yōu)化條件。在誘導分化中，采用懸浮培養(yǎng)技術與懸滴培養(yǎng)技術相結合制備EBs，以0.03％Ⅰ型膠原蛋白為包被介質

14、，以誘導早期acid-FGF，中期含HGF、EGF，晚期含ITS、地塞米松、OSM，并且均含F(xiàn)BS、硫代甘油為培養(yǎng)介質，以EBs分散成單細胞來進行分步誘導18d，所收獲HPCs生長旺盛，形態(tài)典型，并且在所誘導的18dHPCs中有56.7±6.8％的細胞為ALB陽性。 3.HPCs的分化受到細胞基質成份、細胞因子、細胞密度、包被介質、誘導方法等影響因素有關。所使用的優(yōu)化誘導方法，在第12dRT-PCR即可檢測到ALB表達，在第9d

15、RT-PCR可以檢測出AFP表達，特別是在第18d的HPCs，ALB與AFP均成較強陽性表達，HPCs能夠合成糖，尿素氮，可見CK18、CK19陽性細胞，線粒體標志酶COX、SDH均出現(xiàn)陽性表達，表明所誘導的HPCs具有肝細胞樣結構和肝細胞的功能性特征。同時檢測了部分內胚層轉錄因子表達，GATA4和OCT4的表達在ES細胞開始誘導過程中逐漸減弱，6d后基本檢測不到，而HNF3α、HNF4α則相反，表明肝細胞核因子GATA4、OCT4與H

16、NF3α、HNF4α與HPCs誘導分化過程密切相關，并進一步探討了ES細胞分化為肝前體細胞的部分分子機理。 4.通過細胞移植將我們所誘導的18dHPCs移植到處理過的小鼠移植受體，HPCs能夠遷移到肝脾組織整合生長，能表達ALB，無腫瘤或畸胎瘤組織生成，表明我們所誘導的18dHPCs可用作肝細胞移植材料；同時對小鼠移植受體進行喂飼2-AAF、50％PHx肝臟、7Gy60Co亞致死劑量輻照的移植受體模型是可行的，能夠取得較好的移植