多基因修飾組織工程骨中其基因表達(dá)時限的檢測.pdf

1、目的：基因工程和組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為臨床骨缺損修復(fù)提供了更多的治療選擇，利用生物工程相關(guān)技術(shù)體外構(gòu)建組織工程骨仍是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建pEGFP/hVEGF165和pEGFP/hBMP2兩種真核表達(dá)質(zhì)粒，并分別和共同轉(zhuǎn)染至兔成骨細(xì)胞，再以兔脫蛋白骨（DPB）為支架，體外構(gòu)建多基因修飾的組織工程骨，同時對組織工程骨中hVEGF165和hBMP2基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，探討兩種基因在體外表達(dá)的相互影響和基因表達(dá)的時限，為組織

2、工程骨植入體內(nèi)的最佳時間的選擇提供體外對照和相關(guān)的理論支持。 方法：1、以pET22-hVEGF165為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出hVEGF165基因，亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP/hVEGF165，將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP2酶切出hBMP2片段后，同樣方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP/hBMP2，并對兩種質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切和測序鑒定。2、分離、培養(yǎng)出兔原代成骨細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，對細(xì)胞

3、進(jìn)行鏡下形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞化學(xué)及酶學(xué)等鑒定，之后將細(xì)胞分為空白組（A組），pEGFP/hBMP2組（B組），pEGFP/hVEGF165組（C組），pEGFP/hVEGF165+pEGFP/ hBMP2組（D組），用脂質(zhì)體法將兩種質(zhì)粒按分組在體外分別轉(zhuǎn)染至成骨細(xì)胞，采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。3、將轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞分別與DPB支架材料在體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在各組支架上的生長情況，通過RT-PCR和Western Blot分別檢測各組hB

4、MP2和hVEGF165不同時段的表達(dá)情況。 結(jié)果：1、重組pEGFP/hBMP2和pEGFP/hVEGF165質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確。2、通過鏡下形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞化學(xué)及酶學(xué)等鑒定，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)出的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后除空白組外其余三組均可用熒光顯微鏡觀察到的綠色熒光。3、各組細(xì)胞在體外與DPB復(fù)合培養(yǎng)后，隨培養(yǎng)時間的延長，材料中細(xì)胞數(shù)量也隨之增多，RT-PCR結(jié)果顯示D組的hVEGF165 mRNA和hBMP2 m

5、RNA轉(zhuǎn)錄水平均高于其余三組，Western Blot結(jié)果顯示D組在各時間點(diǎn)的hVEGF165和hBMP2蛋白表達(dá)量均高于其他三組，其中hVEGF165蛋白表達(dá)最高峰在10日左右，hBMP2蛋白表達(dá)最高峰在7日左右。 結(jié)論：1、成功構(gòu)建重組pEGFP/hBMP2和pEGFP/ hVEGF165質(zhì)粒。2、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至成骨細(xì)胞，為下一步構(gòu)建基因修飾的組織工程骨準(zhǔn)備種子細(xì)胞。3、成功構(gòu)建hVEGF165和hBMP2多基因修飾的組織工程