吉西他濱與順鉑對人肺癌A549細胞的作用研究.pdf

1、肺癌是對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一,在眾多的治療方法中,化療是治療非小細胞肺癌NSCLC最主要的手段,而吉西他濱(Gemcitabine,GEM)是其中最有效的化療藥之一。順鉑(Cisplatin,CDDP)屬細胞周期非特異性抗腫瘤藥,是應用最廣泛的抗癌藥物之一。其特點是抗癌作用強,抗癌活性高,與其他抗癌藥物無交叉耐藥性,因而常與其他藥物配合使用。許多體內和體外實驗均證實吉西他濱與順鉑兩藥聯用化療藥效明顯高于單藥,二者之間存在

2、協同和相加作用。隨著藥物的聯用,由于藥物濃度的變化而引起的不良反應和副作用也隨之而來,如何在不增加藥物劑量的前提下通過調整用藥順序達到最佳效果迅速成為學者們研究的焦點,不同時序下給藥的劑量,用藥時間及兩藥相互作用的具體機制尚都需要深入的研究,目前,吉西他濱與順鉑聯用的GP方案在肺腺癌中的臨床應用顯示了良好的前景,優(yōu)化最佳時序組合方式為臨床提供選擇尤顯重要。本研究使用人肺腺癌細胞系A549做為研究對象,探討了在不同的給藥時序下的細胞學作用

3、機制,為臨床更好的治療NSCLC提供了實驗室依據。
　　 材料與方法:
　　 1、藥品:注射用鹽酸吉西他濱(澤菲)、順鉑注射液均由江蘇豪森藥業(yè)公司提供。
　　 2、細胞培養(yǎng):人肺腺癌A549細胞系用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　 3、四甲基偶氮唑鹽(tetrazolitim,MTT)法檢測細胞增殖能力取對數生長期的細胞懸液進行細胞計數,稀釋至密度5×104個/

4、ml,分別接種于4個96孔板培養(yǎng)板,每孔加入100ul細胞懸液,即每孔接種5000個細胞。接種24小時后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時分別加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續(xù)孵育4小時后,每孔加入150μl DMSO溶解結晶,選擇波長490 nm在酶聯免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實驗重復3次。繪制細胞生長曲線。
　　 4、流式細胞儀檢測細胞周期
　　 收集不同處理因素的對數生長期細

5、胞制成1×107個/ml細胞懸液。PBS洗滌,取1ml細胞懸液75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后棄上清制成500μl的細胞懸液,加碘化丙啶染液(PI)于4℃避光孵育45分鐘后用FACS Calibur流式細胞儀檢測,ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。
　　 5、流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　 收集不同處理因素的對數生長期細胞制成1×107個/ml細胞懸液。PBS洗滌,加入ANNEXIN V-FITC和PI染料,避光處

6、理,使甩FACS Calibur流式細胞儀檢測凋亡情況,計算細胞凋亡百分率。
　　 6、統(tǒng)計分析:使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理,以均數士標準差(X±SD)表示的數據,其實驗至少重復3次,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、吉西他濱或順鉑單藥對A549細胞的抑制作用
　　 根據兩種藥物血漿峰濃度選擇不同濃度梯度單藥作用于A549,取24小時、48小時、72小時為時間點檢測,所

7、得結果用于計算單藥的半數抑制濃度IC50。吉西他濱作用24小時、48小時、72小時的IC50分別為3.79±0.32 mg/L、1.11±0.12mg/L、0.23±0.06mg/L,72小時的IC50約為24小時的16倍;順鉑作用24小時、48小時、72小時的IC50分別為18.58±2.01mg/L、3.78±0.25 mg/L、0.76±0.10 mg/L,且隨濃度增大抑制作用增大呈量效關系。
　　 2、吉西他濱和順鉑不同

8、時序給藥對A549細胞的抑制作用
　　 根據所測得的單藥作用于A549細胞的半數抑制濃度IC50,我們選擇固定給藥時間來檢測不同時序給藥方案對A549細胞的抑制作用。所得結果計算聯合用藥下抑制率達50％時兩藥的濃度,通過公式求得藥物聯合指數CI。先吉西他濱1天后順鉑1天CI＜1,二者為協同作用;先順鉑1天后吉西他濱1天,CI＞1兩藥為拮抗作用;吉西他濱和順鉑同時應用,CI約等于1,兩藥為疊加作用。
　　 3、吉西他濱和順

9、鉑聯合不同時序給藥對A549細胞凋亡的影響
　　 為探討兩藥聯合作用的機理,吉西他濱和順鉑的用量為各自IC50的1:1對照組凋亡率為2.82％±0.12％;單GEM組凋亡率為14.54％±2.36％;單CDDP組凋亡率為15.06％±1.31％;先GEM后CDDP組凋亡率為25.72％±3.29％;先CDDP后GEM組凋亡率為10.99％±1.04％;GEM與CDDP同時作用組凋亡率為19.24％±3.61％。先用GEM后用CD

10、DP處理時A549細胞的凋亡率高于其他處理組(P＜0.01),有統(tǒng)計學意義。
　　 4、吉西他濱和順鉑聯合不同時序給藥對A549細胞周期的影響
　　 單藥作用時吉西他濱和順鉑都能使S期的細胞比例增多(G VS Control,C VSControl,P＜0.05),先GEM后CDDP作用下G1期和G2期的細胞比例增加(GC VSControl,P＜0.05),先CDDP后GEM作用時主要S期細胞比例增加(CG VSCon