針對Hh信號通路的人惡性膠質瘤靶向治療的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質瘤是顱內最常見惡性腫瘤，其中病理分級為WHOⅢ-Ⅳ級的惡性膠質瘤，病情進展迅速，復發(fā)快，預后差。目前手術結合放、化療的綜合治療是經(jīng)典的治療方法，但對于惡性膠質瘤患者的總體預后改善有限，主要原因在于難以避免的腫瘤復發(fā)。惡性膠質瘤的化療是重要的輔助治療手段，然而由于傳統(tǒng)化療藥物的非特異性、細胞毒性和腫瘤本身的耐藥性使得該類藥物的總體療效欠佳。近年來發(fā)現(xiàn)許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與特定信號通路的異常激活密切相關，因此以細

2、胞特定受體、關鍵基因和調控分子為靶點的輔助治療具有良好的應用前景。
　　 腫瘤干細胞假說認為在腫瘤細胞中僅有一小部分細胞具有自我更新、無限增殖、多向分化潛能的干細胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生，轉移和復發(fā)的根源。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膠質瘤中也存在著這樣一類以CD133陽性作為標記的腦腫瘤干細胞(BTSCs)，并且證明其具有高度的耐藥性、抗凋亡能力以及侵襲能力。這些腫瘤干細胞應該是今后惡性膠質瘤靶向治療的主要研究方向。目前認為腦腫瘤干細胞可能起源于

3、發(fā)生基因突變的正常神經(jīng)干細胞，因而一些負責調控神經(jīng)干細胞自我更新、分化、增殖的關鍵信號通路，如Hh、Wnt、Notch信號通路等，可能在腦腫瘤干細胞中起著重要的作用。其中Hh通路是目前腫瘤干細胞相關研究領域的熱點之一。已有的研究表明：Hh通路既對內源性干細胞的增殖起調節(jié)作用，也可能對腫瘤干細胞起調節(jié)作用，其異常激活能導致多種腫瘤生成，如基底細胞癌、髓母細胞瘤、膠質瘤、胰腺癌等；目前體內外實驗中對該通路的特異性阻斷對這些腫瘤的治療均取得了

4、一定的效果，但其中的具體作用機制還沒有完全闡明。因此對該信號通路的繼續(xù)探索也成為了目前相關腫瘤基礎研究領域的前沿。
　　 目前針對Hh通路應用較多的一類阻滯劑為環(huán)杷明（cyclopamine），其能夠結合Smo受體從而抑制Hh信號通路活性。已有的體內外實驗表明cyclopamine對包括部分膠質瘤在內的多種Hh通路相關性腫瘤有效。然而cyclopamine類抑制劑只能對由Hh信號通路上游基因變化導致異?；罨哪[瘤有作用，而對由S

5、mo級聯(lián)反應以下的參與Hh信號通路調控的分子變化，如sufu基因突變所導致的腫瘤沒有治療效果。因此，進一步尋找Hh通路下游阻滯劑，如Gli轉錄因子阻滯劑，對于Hh通路相關性膠質瘤的干預治療具有重要意義。
　　 方法：
　　 第一部分：通過rt-PCR和免疫熒光技術檢測Hh通路的主要基因Glil在不同的原代細胞及膠質母細胞瘤細胞系中的表達；分別利用real-time PCR、western blot驗證GANT61對Hh通

6、路異常激活的膠質瘤Glil mRNA和Ptchl蛋白的調控作用；利用MTS試驗，驗證GANT61對不同株膠質瘤細胞活性的影響，并根據(jù)此項試驗結果得出的時間?劑量?活性相關曲線確定該藥物的有效濃度；進而借助于PI染色法檢測GANT61對細胞周期的影響，并以Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡。
　　 第二部分：利用免疫磁珠分選技術( MACS)在U87細胞系中分選得到CD133陽性的腦腫瘤干細胞，并通過單克隆形成試驗、免疫

7、熒光標記和裸鼠致瘤試驗鑒定其干細胞樣生物學特性；然后予以GANT61體外作用相應時間后再次檢測腦腫瘤干細胞自我更新能力、干細胞特異性標記的維持以及裸鼠致瘤能力的變化。
　　 第三部分：通過裸鼠皮下接種法構建膠質瘤的種植瘤模型，按療程瘤周注射GANT61后定期測量腫瘤體積變化；收集處理組與對照組新鮮腫瘤組織以PCR和免疫組化技術分別檢測Ptchl mRNA和蛋白水平的變化；以TUNEL法標記凋亡細胞，以BRDU染色法檢測腫瘤細胞的

8、增殖。另取GANT61干預后的腫瘤組織體外再培養(yǎng)并檢測其自我更新能力和體內致瘤能力。
　　 結果：
　　 1.在7例惡性膠質瘤樣本中3例為WHO III級，4例為WHO IV級。其中2/5原代腫瘤細胞和1/2腫瘤細胞系的Glil高表達。但Glil的表達情況與病理分級沒有明確的相關性。
　　 2.5μM濃度的GANT61能夠在體外實驗中時間依賴的阻斷Glil轉錄活性，3個樣本作用48h后Glil mRNA均得到明顯

9、下調，作為Glil下游靶基因之一的Ptchl的蛋白表達也較對照組下降，說明GANT61能通過抑制Glil轉錄活性來阻斷其下游的信號傳導。
　　 3.GANT61對于Glil表達異常增高的惡性膠質瘤具有時間和劑量依賴的細胞活性抑制作用，作用48h可以達到最大抑制效果，其IC50為10μM。
　　 4.10μM的GANT61作用48h可以明顯增加G1亞峰和G0/G1期的細胞比例，這提示GANT61主要通過誘導G1/S期的周期

10、阻滯和增加細胞死亡來減慢膠質瘤細胞增殖。
　　 5.10μM的GANT61作用48h可以通過降低Glil轉錄活性而增加早期凋亡細胞比例。
　　 6.通過MACS技術從U87細胞系中分選出CD133陽性的細胞亞群。經(jīng)驗證分選所得的CD133陽性細胞具有自我更新、多向分化潛能和體內致瘤能力，具有腦腫瘤干細胞樣細胞(BTSCs)的典型特征。
　　 7.CD133陽性組膠質瘤細胞Gill mRNA水平較陰性組明顯增高。1

11、0μMGANT61作用48h后能明顯抑制BTSCs Glil轉錄活性。
　　 8.10μM GANT61共培養(yǎng)2天或20μM GANT61共培養(yǎng)7天都不能明顯增加BTSCs早期凋亡，這提示在BTSCs中Hh通路可能并不是唯一調控其抗凋亡能力的信號通路。
　　 9.CD133陽性細胞與10μ M GANT61共培養(yǎng)7天后，其腫瘤球樣克隆形成能力明顯減弱，CD133陽性率明顯下降，將其接種至裸鼠皮下后未能致瘤。這提示GANT

12、61對BTSCs的體外作用能降低其自我更新能力。
　　 10.用濃度5mg/ml、劑量20mg/kg的GANT61對皮下荷瘤裸鼠作隔天瘤周注射，2周后處理組種植瘤體積較對照組明顯小。
　　 11.對照組瘤體中Ptchl呈高表達，而在治療組經(jīng)過2周GANT61局部皮下注射后瘤體的Ptchl在mRNA和蛋白水平均明顯下降。
　　 12.在體內環(huán)境下GANT61能提高腫瘤的TUNEL陽性率并降低BRDU標記的的陽性率，

13、提示其能增加腫瘤細胞凋亡、抑制增殖。
　　 13.處理組種植瘤消化后經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)仍能形成腫瘤球樣克隆，并具有裸鼠致瘤能力。這提示在體內實驗中單獨使用GANT61不能完全消滅腫瘤干細胞。
　　 結論：
　　 1.在惡性膠質瘤中存在Hh通路活性異常增高的亞型，以Glil mRNA的高表達為主要表現(xiàn)。但Glil的表達情況與病理分級沒有明確的相關性。
　　 2.在體外實驗中GANT61能通過抑制Glil轉錄來降