DJ-1通過激活Nrf2信號通路上調抗氧化酶介導心肌細胞缺氧預適應延遲保護.pdf

1、目的：從Nrf2信號通路及其所調控的抗氧化酶（MnSOD、HO-1）表達改變的角度探討DJ-1介導心肌細胞缺氧預適應（HPC）延遲保護的分子機制。
　　方法：⑴利用親本H9c2細胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，分別經pFlag-hDJ-1重組載體或對照空質粒pFlag瞬時轉染24 h后，建立HPC模型；HPC24h后，通過檢測以下變化，以求觀察DJ-1不同表達水平對HPC預處理H9c2細胞內Nrf2信號通路

2、的影響：Western Blot檢測細胞內DJ-1蛋白表達的變化；免疫共沉淀（Co-IP）檢測Nrf2-Keap1的解離情況；Western Blot檢測Nrf2核轉位變化；染色質免疫共沉淀（ChIP）法檢測胞核內Nrf2與HO-1及MnSOD基因啟動子區(qū)內抗氧化反應元件（ARE）結合的變化。⑵利用親本H9c2細胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1siRNA細胞，分別經pFlag-hDJ-1重組載體或對照空質粒pFlag瞬時轉染24h

3、后，建立HPC模型；HPC24 h后，通過Western Blot檢測細胞內抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表達的變化，以求觀察DJ-1不同表達水平對HPC預處理H9c2細胞內MnSOD、HO-1蛋白表達的影響。⑶利用親本H9c2細胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，分別經pFlag-hDJ-1重組載體或對照空質粒pFlag瞬時轉染24h后，各組細胞分別用Nrf2 siRNA或陰性對照siRNA（NC siRNA

4、）轉染24 h，隨后建立HPC模型；HPC24h后，通過Western Blot檢測細胞內Nrf2及抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表達的變化，以求觀察Nrf2信號通路的抑制對DJ-1所依賴的HPC上調H9c2細胞內MnSOD、HO-1蛋白表達的影響。⑷利用親本H9c2細胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，分別經pFlag-hDJ-1重組載體或對照空質粒pFlag瞬時轉染24h后，各組細胞分別用Nrf2 siRN

5、A或陰性NC siRNA轉染24 h，隨后建立HPC延遲保護模型和缺氧/復氧（H/R）損傷模型，通過檢測以下變化，以求觀察Nrf2信號通路的抑制對DJ-1所介導的HPC延遲保護的影響：MTT法檢測各實驗組心肌細胞存活率的變化；根據(jù)試劑盒說明分別檢測各組細胞內LDH活性變化；應用比色法測定MDA含量；流式細胞術檢測細胞內活性氧（ROS）含量的變化。
　　結果：①在H9c2細胞，HPC24h后能顯著上調DJ-1蛋白表達，同時促進Nrf

6、2與其抑制蛋白 Keap1解離，并促進 Nrf2入核，增加 Nrf2在胞核內與 HO-1及MnSOD基因啟動子區(qū)內ARE的結合。然而，在DJ-1低表達的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，HPC上述效應被逆轉。此外，H9c2/DJ-1 siRNA細胞經pFlag-hDJ-1轉染進行回復實驗后，DJ-1蛋白表達恢復，同時伴隨HPC上述效應的恢復。②在H9c2細胞，HPC24h后能顯著上調HO-1及MnSOD蛋白表達。然而，在DJ-1低表達

7、的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，DJ-1沉默對HPC所誘導的HO-1及MnSOD蛋白表達上調呈現(xiàn)抑制效應。同樣，H9c2/DJ-1 siRNA細胞經pFlag-hDJ-1轉染后，HPC上調HO-1及MnSOD蛋白表達的效應也被恢復。③H9c2細胞經Nrf2 siRNA處理后產生DJ-1沉默相似效應，對HPC所誘導的HO-1及MnSOD蛋白表達上調呈現(xiàn)抑制效應。更為重要的是，H9c2/DJ-1siRNA細胞經pFlag-hDJ-1轉

8、染后，HPC上調HO-1及MnSOD蛋白表達的回復效應也被Nrf2 siRNA所逆轉。④在H9c2細胞，HPC24 h后可顯著提高H/R損傷心肌細胞的生存率，抑制 LDH的活性；并能顯著減少 H9c2心肌細胞 H/R過程中所產生的活性氧（ROS），同時減少MDA的生成。然而，在DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA細胞，HPC上述效應被逆轉。更為有趣的是，H9c2細胞經Nrf2 siRNA處理后同樣產生DJ-1沉默相似效應，對HP