骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植治療腦缺血的實驗研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植治療腦缺血的實驗研究目的神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)及其分離鑒定、培養(yǎng)技術(shù)的建立，使神經(jīng)細胞不可再生的傳統(tǒng)理論面臨巨大挑戰(zhàn)，并為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。但神經(jīng)干細胞數(shù)量少、分布分散，體外培養(yǎng)時取材困難，無免疫原性神經(jīng)干細胞系建立困難，以及異體移植的種屬差異和社會學(xué)、倫理學(xué)等方面的問題都極大地限制了神經(jīng)干細胞的應(yīng)用。成體動物的骨髓中存在一定數(shù)量的骨髓基質(zhì)干細胞(MSCs)，骨髓基質(zhì)干細胞在適當(dāng)條件下

2、可以向神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、和神經(jīng)膠質(zhì)細胞方向分化。MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞的研究工作已有一定突破，但誘導(dǎo)形成的神經(jīng)元樣細胞存在著存活時間不長，24小時后大多死亡的問題。故如何延長MSCs源性的神經(jīng)元樣細胞的壽命是極為重要的。另一方面MSCs移植治療缺血性腦損傷雖己取得一定的進展，但MSCs移植后在體內(nèi)環(huán)境下分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的比率較大而分化為神經(jīng)細胞的比率較小，所以如將骨髓基質(zhì)干細胞在體外分化為神經(jīng)元樣細胞，再行細胞移植將會有事半

3、功倍的效果。 本實驗應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)將大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)和純化，測定MSCs的細胞活力、生長曲線和貼壁率，用形態(tài)學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞。將培養(yǎng)成功的骨髓基質(zhì)干細胞在體外傳代、擴增，以得到一定數(shù)量的細胞。以褪黑素(MT)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)予以干預(yù)，以期延長誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細胞的存活時間，并應(yīng)用生存時間較長的MSCs源性神經(jīng)元樣細胞，對局灶性腦缺血大鼠模型(MCAO)進行細胞移植。觀察植入細胞的分

4、布及存活情況，并探討細胞植入后對MCAO大鼠腦神經(jīng)元C-myc、Erk蛋白及其mRNA表達的影響。 材料和方法 (一)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、擴增純化 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離：應(yīng)用貼壁法結(jié)合密度離心法分離大鼠骨髓基質(zhì)干細胞。 2.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的擴增純化：建立大鼠骨髓基質(zhì)干細胞擴增純化體系，為實驗提供種子細胞。 3.臺盼藍染色測定細胞活力。 4.骨髓基質(zhì)細胞貼壁率檢測。

5、 5.骨髓基質(zhì)干細胞的鑒定：應(yīng)用免疫熒光法鑒定培養(yǎng)細胞的體表標(biāo)記，CD45、CD90。應(yīng)用免疫細胞化學(xué)法鑒定培養(yǎng)細胞的體表標(biāo)記，CD34、CD44。 (二)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化的研究 1.MSCs的培養(yǎng)和純化。 2.MSCs向神經(jīng)細胞的定向誘導(dǎo)分化：應(yīng)用MT、bFGF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化。 3.誘導(dǎo)細胞的免疫熒光法鑒定：免疫熒光法鑒定分化細胞NSE、GFAP的

6、表達。 (三)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分化后移植、治療局灶性腦缺血大鼠的實驗研究 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、擴增。 2.體外MSCs向神經(jīng)元樣細胞誘導(dǎo)分化，分化后細胞在體外以BrdU進行標(biāo)記。 3.大鼠腦局灶性缺血模型(MCAO)的制作及神經(jīng)功能評分。 4.大鼠MSCs源神經(jīng)元樣細胞經(jīng)頸動脈注入MCAO模型。 5.BrdU標(biāo)記細胞的免疫組化染色：觀察植入細胞的成活率。 6.免疫組

7、化染色法測定大鼠腦內(nèi)C-myc、Erk，原位雜交法測定Cmyc、ErkmRNA。觀察細胞植入對上述指標(biāo)的影響。 結(jié)果 (一)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、擴增純化 1.接種1周后細胞集落迅速增多，隨著集落不斷擴大，互相融合，10-12天細胞貼滿培養(yǎng)瓶底，細胞以梭形和園形為主。 2.傳代培養(yǎng)后的細胞不再以成集落方式生長，生長速度比原代要快。 3.P1、P3、P5代MSCs三代細胞在各時間點的貼壁率無

8、顯著性差異。 4.傳代大鼠MSCs潛伏期為1-2天，從第3天起細胞大量增殖進入對數(shù)生長期，第6天達到高峰期，以后進入平臺期。 5.MSCs表達CD90、CD44而不表達造血細胞的表面標(biāo)志CD34、CD45。 (二)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化的研究 1.加入含MT、bFGF的培養(yǎng)液后，3天后見部分細胞胞體收縮，折光性增強，伸出突起，部分細胞胞體收縮成三角形，并有些成為簡單的雙極細胞或多極細胞。

9、 2.誘導(dǎo)72小時細胞開始表達NSE，9-14天陽性細胞增多，以MT+bFGF組變化顯著，而不表達GFAP。 3.誘導(dǎo)分化前Erk蛋白在MSCs胞漿中只有微弱的表達，而在誘導(dǎo)的3天后Erk陽性細胞大量出現(xiàn)。 (三)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分化后移植、治療局灶性腦缺血大鼠的實驗研究 1.MCAO大鼠細胞植入后神經(jīng)功能評分較對照組明顯改善。 2.細胞植入組大鼠腦內(nèi)48小時在損傷側(cè)腦中見散在BrdU陽性細胞，7天

10、后BrdU陽性細胞逐漸增多，14天時陽性細胞數(shù)不再增多。 3.MCAO大鼠在細胞植入48小時內(nèi)，在基底節(jié)、皮層、海馬區(qū)神經(jīng)細胞均可見C-mycmRNA陽性細胞。 4.MCAO大鼠腦中Erk蛋白、Erkm-RNA陽性細胞在細胞植入24-48小時增多。1周后Erk蛋白陽性細胞仍保持在較高比例。 結(jié)論 1.密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合是分離骨髓基質(zhì)干細胞簡便·3·高效的方法，大量擴增MSCs是可能的。MSC