間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠自身免疫性葡萄膜炎作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，可用于多種自身免疫性疾病的治療。葡萄膜炎是眼科常見的自身免疫性疾病，本研究通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)動(dòng)物模型，觀察MSCs對(duì)EAU的治療作用，檢測(cè)MSCs對(duì)EAU病程中各免疫細(xì)胞群細(xì)胞因子及IL-27表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響，初步探討MSCs治療EAU的機(jī)制

2、。
　　方法：
　　1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MSCs進(jìn)行表型鑒定。
　　2.雄性Lewis大鼠75只隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、0天、12天干細(xì)胞治療組。皮下注射完全弗氏佐劑乳化的光感受器維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptorbinding protein，IRBP)R16肽段免疫建立EAU動(dòng)物模型，分別在免疫后當(dāng)天及12天尾靜脈輸注MSCs，連續(xù)3天。對(duì)照組輸注等體

3、積的磷酸鹽緩沖液。
　　3.自免疫后第4天裂隙燈下觀察各組大鼠眼部表現(xiàn)，參照Caspi標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
　　4.分別在免疫后第6、9、12、15、20天處死大鼠，摘除眼球，HE染色后進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，參照Caspi標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
　　5.分別在免疫后第6、9、12、15、20天處死大鼠，分離脾臟淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)72小時(shí)后ELISA檢測(cè)Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞因子及IL-27表達(dá)量，分析其動(dòng)態(tài)變化

4、趨勢(shì)。
　　6.取各組大鼠脾臟淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)Th17及Treg占CD4+細(xì)胞的比例，分析其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。
　　7.取免疫后第12天EAU大鼠脾臟淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞，與MSCs共同接種并體外培養(yǎng)72小時(shí)，ELISA檢測(cè)Th1/Th2/Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子及IL-27表達(dá)量。
　　8.取免疫后第6、9、12、15、20天各組大鼠房水，ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-10及IL-27的表達(dá)量

5、，分析其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)并鑒定MSCs。
　　2.成功建立了EAU動(dòng)物模型。
　　3.對(duì)照組大鼠免疫后第6天開始出現(xiàn)EAU癥狀，第12天達(dá)高峰，其后逐漸減輕，MSCs治療組EAU癥狀明顯減輕，較對(duì)照組炎癥評(píng)分顯著降低(P<0.05)。
　　4.免疫后第6天對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，12天達(dá)高峰，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂破壞，其后細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。MSCs治療組組織學(xué)評(píng)分較對(duì)

6、照組顯著降低(P<0.05)。
　　5.脾臟淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子ELISA測(cè)定結(jié)果：對(duì)照組Th1、Th17型細(xì)胞因子表達(dá)量與EAU病情變化趨勢(shì)相同，與組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，MSCs治療組表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組顯著減低(P<0.05)。Th2、Treg型細(xì)胞因子及IL-27表達(dá)量與EAU病情變化趨勢(shì)相反，與組織病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，MSCs治療組表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。
　　6.Th17、Treg流式細(xì)胞

7、術(shù)結(jié)果：對(duì)照組Th17群百分比與EAU病情變化趨勢(shì)相同，與組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，MSCs治療組Th17百分比較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。對(duì)照組Treg群百分比與EAU病情變化趨勢(shì)相反，與EAU組織病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，MSCs治療組Treg百分比較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。
　　7.共培養(yǎng)顯著降低了IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-17的表達(dá)量，增加了TGF-β、IL-4、IL-10及IL-27的表達(dá)量(P<0.0

8、5)。
　　8.房水細(xì)胞因子ELISA結(jié)果：對(duì)照組房水IFN-γ表達(dá)量與EAU病情變化趨勢(shì)相同，與組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，MSCs治療組IFN-γ表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。對(duì)照組房水IL-10表達(dá)量與EAU病情變化趨勢(shì)相反，與組織病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，MSCs治療組房水IL-10、IL-27表達(dá)量顯著增高(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Th1、Th2、Th17及Treg均參與了EAU的發(fā)生發(fā)展，Th1、Th

9、17是EAU的主要效應(yīng)細(xì)胞群。Th2、Treg對(duì)EAU具有保護(hù)作用。
　　2.MSCs治療顯著抑制了EAU的發(fā)生發(fā)展。
　　3.MSCs通過(guò)抑制IL-2、IL-6等促Th1、Th17分化因子的表達(dá)，減少了EAU病程中Th1、Th17細(xì)胞群的數(shù)量及其效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的表達(dá)；通過(guò)增加IL-4、TGF-β等促Th2、Treg分化因子的表達(dá)，增加了EAU病程中Th2、Treg細(xì)胞群數(shù)量及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的表