氣腫疽nanA與fliA融合基因亞單位疫苗的制備及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、為了制備安全且有效的氣腫疽新型疫苗，控制氣腫疽的暴發(fā)，本研究建立了氣腫疽的原核表達(dá)載體，制備了氣腫疽融合基因亞單位疫苗和單基因亞單位疫苗，并對(duì)兩種疫苗的免疫水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　本研究根據(jù)已報(bào)道的氣腫疽梭菌的fliA和nanA基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，以氣腫疽梭菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出兩段大小分別為429 bp的fliA基因片段和1113 bp的nanA片段。利用SOE-PCR串聯(lián)兩個(gè)片段，在引物中加入了柔性Linker，得到大

2、小約為1587 bp的融合基因，并將該融合基因和鞭毛基因分別與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，獲得克隆載體pMD18-fliA和pMD18-fliA-nanA。繼而對(duì)克隆載體進(jìn)行雙酶切，獲得帶有黏性末端的fliA片段和fliA-nanA片段,與具有相同黏性末端的pEGX-4T-1原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中，從而構(gòu)建出了重組質(zhì)粒pEGX-4T-fliA-nanA

3、和pEGX-4T-fliA原核表達(dá)載體。對(duì)重組質(zhì)粒pEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA進(jìn)行雙酶切鑒定、PCR鑒定、及序列測(cè)定后，將三項(xiàng)鑒定均為陽(yáng)性的克隆使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳可見(jiàn)大小約83 kDa大小的片段，和42 kDa大小的片段，進(jìn)行western-blotting可見(jiàn)目的條帶有反應(yīng)原性。將蛋白進(jìn)行純化后對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。使用間接ELISA對(duì)小鼠的體液免疫進(jìn)行測(cè)定。使用細(xì)胞因子IL-2

4、、IL-4和IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫水平進(jìn)行測(cè)定。
　　研究結(jié)果表明，F(xiàn)liA(C)蛋白與FliA(C)-NanA融合蛋白均能使小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，在相同免疫劑量下，融合蛋白組的體液免疫水平明顯高于鞭毛蛋白組，該結(jié)果表明，神經(jīng)氨酸酶對(duì)鞭毛蛋白的免疫原性有增強(qiáng)的作用。融合蛋白比鞭毛蛋白可以更快誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-2、IFN-γ。IL-4檢測(cè)結(jié)果表明，融合蛋白與鞭毛蛋白在該反應(yīng)中相差不大，只是融合蛋白加快了IL