心肌短暫缺血-再灌注反應(yīng)基因的篩選、克隆和功能初步研究.pdf

1、短暫的心肌缺血-再灌注可以誘導(dǎo)許多具有細(xì)胞保護(hù)作用的基因表達(dá)上調(diào),這些表達(dá)上調(diào)的基因是心肌內(nèi)源性保護(hù)分子機(jī)制的重要組成部分.該文采用大鼠心肌短暫缺血-再灌注動(dòng)物模型,運(yùn)用抑制消減雜交方法,構(gòu)建了大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)基因的消減cDNA文庫(kù).通過反向Northern點(diǎn)雜交從文庫(kù)中篩選了85個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序.通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì),獲得了31個(gè)已知基因和18個(gè)可能代表新基因的EST片段.從以上所獲的差異表達(dá)基因中

2、任選5個(gè)進(jìn)行RT-PCR分析,任選兩個(gè)進(jìn)行Northern雜交分析,均證實(shí)其在缺血-再灌注組心肌組織中表達(dá)上調(diào).在所篩到的31個(gè)已知基因中,多個(gè)基因已有文獻(xiàn)報(bào)道在心肌缺血-再灌注時(shí)表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮心肌保護(hù)作用,另一些已知基因與心肌缺血-再灌注的關(guān)系至今未見報(bào)道.篩選得到的18個(gè)可能代表新基因的EST片段已在GenBank中登錄.對(duì)以上已知基因進(jìn)行進(jìn)一步功能分析和對(duì)未知基因進(jìn)行克隆,可能為揭示心肌的內(nèi)源性保護(hù)分子機(jī)制提供新的線索和思路.為了

3、初步探討Mip1的功能,我們首先通過Northern雜交檢測(cè)了Mip1在大鼠心肌缺血-再灌注后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)該基因在再灌后1小時(shí)即表達(dá)增加,一直持續(xù)至12小時(shí).隨后我們構(gòu)建了Mip1與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達(dá)質(zhì)粒Mip1-pEGFP-N1,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入小鼠C<,2>C<,12>肌原細(xì)胞株,觀察其在正常和活性氧刺激時(shí)的亞細(xì)胞定位.綜上所述,我們通過抑制消減雜交技術(shù)和cDNA芯片相結(jié)合篩選得到了多個(gè)大鼠心肌短暫缺血

4、-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)生改變的基因,并構(gòu)建了大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)基因的消減cDNA文庫(kù).從所篩選得到的EST片段中,我們通過生物信息學(xué)方法和5′RACE技術(shù)相結(jié)合,克隆了一個(gè)大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的新基因Mip1,該基因?qū)俚湫偷腃<,2>H<,2>型鋅指蛋白,可能為一核轉(zhuǎn)錄因子,并具有多項(xiàng)潛能.初步功能研究結(jié)果顯示,Mip1具有細(xì)胞保護(hù)和促細(xì)胞生長(zhǎng)功能,可能是心肌內(nèi)源性保護(hù)分子機(jī)制的重要組成部分.以上工作為揭示