甘藍(lán)型油菜突變體Cr3529抑制性反向消減文庫的構(gòu)建和BnCr4基因全長cDNA的克隆.pdf

1、為了探究黃化性狀突變的分子機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜幼葉黃化突變體Cr3529的抑制性反向消減文庫。經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，反向消減文庫的有效重組率為76.5％，其中插入的cDNA片段大小在100bp到1000bp之間。再通過斑點(diǎn)雜交對(duì)100個(gè)隨機(jī)挑選的含有插入片段的陽性克隆進(jìn)行初步地差異篩選，得到差異比較明顯的克隆的比率為75％。隨機(jī)選取36個(gè)陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。用DNAssist序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分

2、析比較，cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較。　　以甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)幼葉黃化突變體Cr3529的幼葉為材料提取RNA，在已經(jīng)構(gòu)建的油菜幼葉黃化突變體Cr3529反向消減文庫中選取一個(gè)已經(jīng)測(cè)序的編碼未知功能蛋白質(zhì)的基因片段，設(shè)計(jì)特異引物并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成和Race-PCR技術(shù)，克隆得到該基因片段的cDNA全序列，命名為BnCr4。序列分析表明，該基因cDNA的開放閱讀框?yàn)?395bp，編碼46

3、5個(gè)氨基酸。對(duì)推測(cè)的BnCr4氨基酸序列的組成、同源性、物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)推測(cè)的BnCr4氨基酸序列與擬南芥中一個(gè)功能未知的蛋白質(zhì)有較高的同源性(81％)。隨后又對(duì)該基因編碼蛋白的二硫鍵的形成、親水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步地預(yù)測(cè)。大致將它的氨基酸序列分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，靠近5’端的約110個(gè)氨基酸主要以無規(guī)則卷曲為主，含有較多的β-轉(zhuǎn)角；中段的約240個(gè)氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)比較豐富，可能在功能上有重要作用；而靠近3’端的約1