TLR8激動劑對樹突狀細胞的調節(jié)及其在腫瘤免疫中的作用.pdf

1、目的:
　　(1)利用來源于C57BL/6小鼠的樹突狀細胞系DC2.4，探討聯合應用人TLR8激動劑CL075和TLR7/8調節(jié)劑Poly dT后，小鼠TLR8能否被激活以及TLR8激活以后對TLR8以及相關細胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表達的影響;
　　(2)建立小鼠腫瘤模型(Lewis肺癌模型)，進一步探討TLR8激活對腫瘤生長的影響及其抗腫瘤免疫應答的調節(jié)機制;
　　(3)利用臨床腫瘤標本（人宮頸癌

2、組織）以及相關細胞系（人宮頸癌Hela細胞），觀察TLR8在人體癌組織的表達以及TLR8激活以后對腫瘤細胞增殖和生存的影響，以便為以TLR8為靶點的腫瘤免疫治療提供實驗和理論依據。
　　方法:
　　(1)在體外實驗中，DC2.4細胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察其經PBS、CL075、Poly dT以及CL075與Poly dT聯合用藥刺激后的形態(tài)學變化;RT-PCR或qPT-PCR、

3、免疫熒光法以及Western-blot檢測TLR8在DC2.4的表達與分布;qPT-PCR、ELISA法檢測DC2.4經上述藥物刺激以后相關細胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表達;MTT比色法檢測TLR8激動劑激活受體后對DC2.4抗原提呈功能的影響;qRT-PCR與Western-blot檢測經藥物刺激后對TLR8受體表達的影響。
　　(2)在體內實驗中，取純系C57BL/6小鼠，22-24克，雄性，隨機分成三組，每組

4、10只。小鼠右側腹壁消毒后，皮下注射Lewis肺癌細胞3.0×106個細胞/只，建立Lewis肺癌小鼠模型。Lewis細胞接種于小鼠當天即開始給藥，PBS、CL075和Poly dT均經腹腔注射給藥。CL0750.2μg+Poly dT5μg（低劑量組）每天給藥一次，PBS組、CL0752μg+Poly dT50μ g（高劑量組）每兩天給藥一次。接種Lewis肺癌細胞第1天后，隔天用電子天平測量小鼠體重一次，7天后，用脫毛劑對各實驗組小

5、鼠進行脫毛，觀察腫瘤的生長情況。肉眼觀察并按摸皮下結節(jié)，用游標卡尺隔天測量1次腫瘤結節(jié)的長徑a及短徑b，單位mm，根據公式V=1/2×a×b2估算腫瘤體積。給藥后第二十一天，在麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠，取出腫瘤組織，用電子天平稱重，計算每組平均瘤重，qRT-PCR檢測小鼠脾臟及引流淋巴結中TLR8、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-β和Foxp3的表達，FCM檢測小鼠脾臟及引流淋巴結中CD11c+細胞TLR8的表達，FCM檢測小

6、鼠脾臟及引流淋巴結中CD3+CD8-IFN-γ+T細胞、CD3+CD8+IFN-γ+T細胞以及CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例。
　　(3)臨床標本分析采用病人宮頸癌組織，并結合宮頸癌細胞系進行相關驗證工作。人宮頸癌細胞系Hela細胞用含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用RT-PCR/qRT-PCR、免疫熒光法檢測Hela細胞TLR8的表達與分布，流式細胞術、MTT比色法檢測TLR8激動劑CL075對宮頸癌細胞周

7、期和細胞凋亡的影響，qRT-PCR檢測COX-2、Bcl-2和VEGF在經CL075刺激的人宮頸癌細胞株中的表達。取人宮頸癌組織及健康對照組樣本，qRT-PCR檢測TLR7、TLR8與Bcl-2或VEGF的表達并分析其相關性，最后綜合分析TLR8在人宮頸癌細胞的表達及TLR8激動劑對腫瘤增殖和存活的影響。
　　結果:
　　(1)光學顯微鏡下觀察發(fā)現，DC2.4細胞呈梭形、星狀和多角形，與成熟的樹突狀細胞相比，樹狀突起不長，個

8、體較小，細胞透亮，細胞核清晰。分別用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24 h后，繼續(xù)在光鏡下觀察發(fā)現:經CL075+Poly dT聯合用藥刺激的DC2.4細胞樹突增多且伸長，而未刺激、單用CL075或Poly dT刺激的DC2.4細胞樹突較短且少。RT-PCR/qPT-PCR、免疫熒光法以及Western-blot分別從mRNA水平和蛋白水平證實DC2.4細胞表達TLR8，而且TLR8主要分布于細胞漿

9、內。通過qRT-PCR和ELISA檢測發(fā)現，與對照組相比，無論是mRNA水平還是蛋白水平，CL075+Poly dT聯合用藥組細胞分泌TNF-α和IL-12的水平均顯著增加（*p＜0.05），而IL-10的分泌水平顯著降低（*p＜0.05）。盡管CL075處理組細胞TNF-α mRNA、TNF-α蛋白和IL-12 mRNA水平也略有增加，但與對照組相比均無統計學意義，而Poly dT處理組DC2.4細胞TNF-α、IL-12和IL-10

10、的mRNA和蛋白表達量均無變化。混合淋巴細胞反應實驗發(fā)現:與對照組相比，經CL075+Poly dT刺激72 h后的DC2.4可促進T淋巴細胞增殖（與對照組相比，**p＜0.01），且T細胞與DC的比例為5∶1時刺激作用更明顯。進一步的研究發(fā)現，CL075+Poly dT聯合處理組的DC2.4細胞中TLR8mRNA和TLR8蛋白的表達量明顯高于陰性對照組（*p＜0.05），CL075或Poly dT單獨處理組DC2.4細胞TLR8的表達

11、量與陰性對照組相比無明顯變化。
　　(2)小鼠體內實驗結果發(fā)現，腹腔注射CL075與Poly dT有效抑制了腫瘤的生長。CL075+Poly dT高劑量組小鼠的腫瘤體積與腫瘤重量明顯小于PBS對照組（*P＜0.05，n=10）。與PBS組相比，CL0752μg+ PolydT50μg（高劑量）組、CL0750.2μg+Poly dT5μg（低劑量）組小鼠體重無明顯差別。qRT-PCR檢測發(fā)現，高劑量CL075+Poly dT可以顯

12、著增加荷瘤小鼠脾臟和引流淋巴結IL-12 mRNA的表達，引流淋巴結中TNF-α mRNA的表達也顯著增加，而抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的mRNA在脾臟和引流淋巴結中的表達量則明顯降低（與對照組相比，*P＜0.05或**P＜0.01，n=4）。流式細胞術的實驗結果進一步證實，高劑量CL075+Poly dT可以促進脾臟和引流淋巴結中CD3+CD8-IFN-γ+T細胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細胞的增殖，而明

13、顯抑制CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖（與對照組相比，*P＜0.05或**P＜0.01，n=6），證明CL075與PolydT聯合應用一方面通過刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等細胞因子，誘導Th1型應答和CD8+細胞毒作用，從而增強小鼠的抗腫瘤免疫應答;另一方面，CL075與Poly dT合用，可通過減少荷瘤小鼠體內抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表達，和抑制CD4+CD25+Foxp3+ Treg

14、細胞的增殖而負向調控腫瘤免疫耐受，從而有效增強了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫應答，延緩了腫瘤的發(fā)展進程。本研究同時還發(fā)現，與高劑量CL075+Poly dT相比，低劑量CL075+PolydT抑制腫瘤生長和增強抗腫瘤免疫的作用雖然不如高劑量明顯，但仍有一定的作用。而且，低劑量CL075+Poly dT可以明顯誘導脾臟和引流淋巴結中CD11c+細胞TLR8的表達，這和我們在體外實驗中發(fā)現的CL075與Poly dT合用誘導DC2.4細胞TLR8表

15、達的實驗結果相一致。
　　(3)我們采用RT-PCR和qRT-PCR檢測了包括Hela細胞在內的十三種人類腫瘤細胞系，包括95D、HepG2、NICH446、U266、SGC、HCT-8、BGC、SW620、A549、HT1080、SKOV-3和U937等細胞TLR8的表達，結果發(fā)現，SKOV-3、U937和Hela表達高水平的TLR8 mRNA，胃癌SGC，HCT-8，BGC，SW620，A549和HT1080表達低水平TLR8

16、;而在95D、HepG2、NICH446或U266細胞沒有檢測到TLR8 mRNA。TLR8 mRNA在宮頸癌細胞系中的表達水平顯著高于其他細胞系，免疫熒光染色表明Hela細胞表達TLR8蛋白，而且TLR8分布于細胞漿內。用不同濃度的TLR8激動劑CL075處理HeLa細胞48小時后，流式細胞術檢測發(fā)現G2/M+S期細胞的百分比增加，提示細胞增殖增加，這一結果被MTT法進一步證實。不同于順鉑，CL075沒有誘導Hela細胞凋亡。CL07

17、5(1μg/ml)處理24小時后，Hela細胞中COX-2，BCL-2和VEGF mRNA水平顯著增加并在48小時達到峰值。定量RT-PCR結果表明，與沒有癌癥患者的宮頸組織相比，宮頸癌患者組織樣本中TLR7和TLR8的mRNA水平增高。與此相反，TLR9在癌癥患者和對照組組織樣本中的表達沒有明顯差異，此外，Bcl-2和VEGF在宮頸癌患者的癌組織中的表達水平也顯著增加。采用Spearman分析，我們發(fā)現宮頸癌樣本中TLR8和Bcl-2

18、或VEGF的表達水平之間存在正相關，而TLR7和Bcl-2或VEGF mRNA表達水平的變化并無明顯相關性。
　　結論:
　　(1)人TLR8激動劑CL075與TLR7/8調節(jié)劑Poly dT聯合應用可以有效激活小鼠TLR8，而且小鼠TLR8活化以后產生與人TLR8相似的效應，如誘導髓系樹突狀細胞分泌TNF-α、IL-12，減少IL-10的分泌，有利于誘導Th1型免疫，增強DC的抗原提呈功能。因此，可以將[CL075+Pol

19、y dT]作為工具藥，以小鼠為模型體內外研究TLR8的功能。
　　(2) TLR8可以作為腫瘤免疫治療的重要靶點。在體外，TLR8激動劑誘導DC2.4分泌TNF-α和IL-12，增強DC2.4的抗原提呈功能，而且這些作用可能和DC2.4細胞TLR8的上調有關;在體內，TLR8激動劑促進荷瘤小鼠Th1型免疫應答炎性細胞因子（TNF-α和IL-12）的產生、減少包括IL-10，TGF-β和Foxp3的免疫抑制因子的分泌，刺激CD3+C

20、D8-IFN-γ+T細胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細胞的增殖，抑制CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖，從而增強Lewis肺癌模型小鼠的抗腫瘤免疫應答，延緩腫瘤的發(fā)展進程，并且小劑量CL075+PolydT上調樹突狀細胞TLR8的表達以增強其對激動劑的反應。這些結果表明，TLR8的活化以及DC等免疫細胞TLR8的上調有利于增強抗腫瘤免疫應答。
　　(3)然而，不同的腫瘤以及發(fā)生于不同個體的同一種腫瘤具有明顯的非均一性，