七葉皂苷對(duì)P-糖蛋白的影響及MDR1 C2005T基因多態(tài)位點(diǎn)功能研究.pdf

1、自古以來(lái)天然中草藥在我國(guó)有著廣泛的使用,國(guó)家十分重視對(duì)傳統(tǒng)中草藥的研究,在早期對(duì)中草藥提取成分進(jìn)行高通量的篩選是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的新課題。中草藥成分復(fù)雜,大都以口服給藥途徑為主,研究其在胃腸道的吸收顯得尤為重要。近幾十年來(lái),人們對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行了深入研究,對(duì)這些蛋白的作用和分子機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí),其中以P-糖蛋白最受關(guān)注。人類P-糖蛋白由位于第7條染色體上的ABCC1基因編碼,是ATP結(jié)合盒(ATP bindingcassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)

2、蛋白超家族成員之一。P-糖蛋白具有ATP酶活性,利用水解ATP釋放的能量將藥物泵出細(xì)胞外。P-糖蛋白在正常人體的小腸有著豐富的表達(dá),它能限制藥物的攝取,是影響藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的重要因素。確定化合物是否是P-糖蛋白的底物,對(duì)于研究該化合物的藥代動(dòng)力學(xué)十分重要。目前常用的研究方法有以下幾種：頂部表達(dá)P-糖蛋白極化細(xì)胞單層細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型,如Caco-2細(xì)胞模型；高表達(dá)P-糖蛋白極化細(xì)胞單層細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型,如LLC—PK1/MDR1和MD

3、CKII/MDR1細(xì)胞模型；高表達(dá)P-糖蛋白細(xì)胞的藥物攝?。蝗鏐cap37/MDR1細(xì)胞模型；富含P-糖蛋白的細(xì)胞囊膜與藥物的直接作用。
　　 娑羅子是歐洲七葉樹(shù)、日本七葉樹(shù)和中國(guó)天師栗的果實(shí)。七葉皂苷是從娑羅子中分離出來(lái)的一種重要組分,屬于三萜皂苷類的化合物。七葉皂苷具有消炎、抗?jié)B出、增加靜脈張力、改善血液循環(huán)以及糾正腦功能失常等作用,臨床應(yīng)用廣泛。但是,七葉皂苷在人體內(nèi)的生物利用度不高。研究發(fā)現(xiàn),七葉皂苷能抑制P-糖蛋白活性

4、。藥物對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的影響,是導(dǎo)致藥物相互作用的主要因?yàn)橹弧榱俗畲笙薅鹊販p少因藥物相互作用而導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng),指導(dǎo)臨床合理用藥,研究已知藥物對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的影響具有重要的臨床意義。基于以上研究背景,本課題旨在研究七葉皂苷對(duì)P-糖蛋白在體外和體內(nèi)產(chǎn)生的影響及其臨床意義。通過(guò)考察七葉皂苷對(duì)P-糖蛋白功能的影響以及P-糖蛋白對(duì)七葉皂苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,探討藥物與P-糖蛋白的相互作用,并進(jìn)一步通過(guò)嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床實(shí)驗(yàn),以他林洛爾為探藥,基

5、于轉(zhuǎn)運(yùn)體的遺傳多態(tài)性對(duì)其功能的影響,在整體藥代動(dòng)力學(xué)水平和藥物相互作用層面探討七葉皂苷對(duì)P-糖蛋白活性的影響,為臨床上藥物相互作用及個(gè)體反應(yīng)差異提供分子水平的解釋,并為臨床實(shí)施中西藥合理運(yùn)用和基因?qū)蛐詡€(gè)體化用藥提供指導(dǎo)。本研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴穩(wěn)定表達(dá)MDR1-LLC-PK1細(xì)胞平臺(tái)的建立全長(zhǎng)的MDR1 cDNA片段經(jīng)過(guò)酶切與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)相連,酶切和DNA測(cè)序確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)建正確。質(zhì)粒pcDN

6、A3.1/MDR1通過(guò)Lipo2000轉(zhuǎn)染LLC-PK1細(xì)胞,經(jīng)G418篩選得到抗性單克隆。所建立的穩(wěn)定表達(dá)MDR1的LLC-PK1細(xì)胞和空轉(zhuǎn)載體pcDNA3.1(-)的LLC-PK1細(xì)胞相比,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)MDR1的mRNA表達(dá)明顯升高；western blot表明,P-糖蛋白的表達(dá)發(fā)生了從無(wú)到有的變化；激光共聚焦顯示,P-糖蛋白定位于LLC-PK1/MDR1細(xì)胞膜上；藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LLC-PK1/MDR1對(duì)秋水仙素

7、的敏感性遠(yuǎn)低于對(duì)照細(xì)胞。
　　 ⑵MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示100μM七葉皂苷及50μM維拉帕米對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,細(xì)胞活性>90％；七葉皂苷和維拉帕米不會(huì)激發(fā)或淬滅熒光,不對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾；60分鐘內(nèi),細(xì)胞對(duì)羅丹明123的攝取最快；1-50μM七葉皂苷對(duì)P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明123外排有顯著抑制作用(P<0.05),且呈劑量依賴性,50μM七葉皂苷使細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加123％；七葉皂苷可以抑制P-糖蛋白功能,但其抑制效果較維拉帕米弱,50μM

8、七葉皂苷的抑制效果約為50pM維拉帕米的30％。
　　 ⑶反向高效液相-質(zhì)譜檢測(cè)LLC-PK1/MDR1細(xì)胞內(nèi)七葉皂苷的方法學(xué)建立。流動(dòng)相乙腈:10mM甲酸銨=40:60(V/V；含0.2％甲酸)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。采用電噴霧電離正離子模式(ESI+),毛細(xì)管電壓3.1kV,去溶劑氣溫度400℃,離子源溫度119℃。七葉皂苷在0.039-20μg/mL,范圍內(nèi)線性良好,七葉皂苷的萃取回收率大

9、于80.6％,三個(gè)濃度的日內(nèi)、日間差均小于17％,最低定量限為O.039μg/mL。七葉皂苷在37℃下細(xì)胞的攝取量隨濃度的增加而增加,然而通過(guò)比較藥物濃度與攝取量的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)七葉皂苷的攝取曲線是直線,反映了藥物的吸收可能是被動(dòng)擴(kuò)散過(guò)程。同時(shí),在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的變化,藥物的表觀滲透系數(shù)(Papp)保持穩(wěn)定,進(jìn)一步證實(shí)藥物的吸收是被動(dòng)擴(kuò)散。
　　 ⑷采用他林洛爾作為探藥,在不同MDR1基因型個(gè)體研究了七葉皂苷對(duì)人體

10、P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響。連續(xù)服用14天七葉皂苷后,他林洛爾AUC(0～36)增加了54.7％,AUC(0～∝增加了56.4％,Cmax增加了35.0％,而達(dá)峰時(shí)間tmax和半衰期t1/2沒(méi)有發(fā)生顯著改變。七葉皂苷顯著增加他林洛爾的血藥濃度,提示七葉皂苷在人體內(nèi)抑制了P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
　　 ⑸綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得到如下結(jié)論：①成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)P-糖蛋白的LLC-PK1細(xì)胞平臺(tái),P-糖蛋白定位準(zhǔn)確,具有功能意義。②七葉皂苷對(duì)