白細胞介素-7基因治療卵巢癌的體外研究.pdf

1、浙江大學碩士學位論文白細胞介素7基因治療卵巢癌的體外研究姓名：程蓓申請學位級別：碩士專業(yè)：婦產科學指導教師：謝幸葉大風2001.5.1塑堊查蘭堡—蘭二_』生—垡—蘭二2王—————————————一RTPCR技術從人脾組織中獲取IL7cDNA基因，與克隆載體PMDl8一T連接構建PMDl8，TIL7重組體，用BamHJ及HindlII雙酶切pBKCMV和PMDl8I“IL7，將酶切后的IL7和pBKCMV連接起來構建hlL7原核、真核雙

2、相表達重組體DBKCMVIL7，進一步用考馬斯亮藍染色法檢測pBKCMVIL7在原核細胞DH5a中的表達。結果：成功獲取人IL7cDNA基因，經測序證實對碼，序列無誤；PMDl8T1L7和口BKCMVIL7重組體經PCR和酶切鑒定證實IL7已克隆進表達載體；經IPTG誘導后，行全菌SDS—PAGE，結果見重組體轉化菌株在45KD處有增強條帶。結論：從人脾組織成功構建了人IL7克隆重組體PMDl8一TIL一7：利用上述重組體，成功構建了人

3、IL7原核、真核雙重高效表達重組體pBKCMV—IL7，其可在大腸桿菌DH5口中，經1PTG誘導，產生45KD左右的融合蛋白。r—≯一。第二部分、穩(wěn)定表達IL7的SKOV3細胞株的建立／廠／目的：將【L7cDNA基因轉染SKOV3，觀察IL7基因轉染前后腫瘤細胞IL7mRNA及蛋白的表達，建立穩(wěn)定表達IL7的SKOV3細胞株。方法：用脂質體介導法將pBKCMVIL7基因轉染SKOV3，行G4】8篩選，并用R丁PCR、WesternBlo

4、t及ELISA法測定轉染后pBKCMVIL7重組體在SKOV3細胞中mRNA和蛋白的表達。同時以轉染空載體pBKCMV為對照。結果：1換用選擇性培養(yǎng)基后，大部分轉染pBKCMV1L7及pBKCMV的SKOV3細胞(分別用SKOV3IL一7和SKOV3Neo表示)在1周后死亡，少數轉染細胞繼續(xù)生長增殖，SKOV3IL7細胞在選擇培養(yǎng)基中生長16周仍有抗性，而未轉染的SKOV3細胞則在l周后完全裂解死亡。2基因轉染后812周，SKOV3IL

5、7、SKOV3Neo及SKOV3細胞抽提的總RNA，經DNase消化后，直接PCR，未出現IL7(639bP)及pBKCMV(226bp)的條帶，而以IL7為引物的RTPCR，SKOV3IL7細胞出現639bp的陽性條帶，SKOV3Neo及SKOV3細胞未見陽性條帶。以pBKCMV為引物的RTPCR，SKOV3IL7細胞出現865bp的陽性條帶，SKOV3Neo出現226bp的陽性條帶，SKOV3細胞未見陽性條帶。3基因轉染后lO周，S