從成人正常睪丸中分離精子細(xì)胞及其cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、目的與意義 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和新型膜滲透性DNA熒光染色劑SYBR-14從人類睪丸中分離單倍體的精子細(xì)胞，并構(gòu)建精子細(xì)胞的cDNA文庫，以此來研究人類精子形成的表達(dá)譜。為高通量發(fā)現(xiàn)和尋找精子形成相關(guān)的新基因，闡明精子形成的分子機(jī)制以及尋找基因治療精子形成障礙、免疫避孕、免疫性不孕的診斷新靶位點(diǎn)提供基礎(chǔ)。 材料與方法 標(biāo)本為成人正常的睪丸。利用物理方法和酶消化制成單細(xì)胞懸液；運(yùn)用改良的非連續(xù)Percoll(15％、22％、30％、

2、40％)密度梯度離心，對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行初步的純化及富集；取22％密度層細(xì)胞利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的分選，根據(jù)細(xì)胞物理參數(shù)FSC(forward angle light scatter)、SSC(90°light scatter)從細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)地進(jìn)行分選；再采用SYBR-14／PI熒光染色，通過DNA熒光染色強(qiáng)度差別進(jìn)行分選。所分選的精子細(xì)胞進(jìn)行巴氏染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、熒光原位雜交(nuoresce in situ hybrid

3、ization，F(xiàn)ISH，X／Y混合探針)和PI染色后DNA含量檢測(cè)。所獲取的細(xì)胞采用SMART(Switch Mechanism At the 5’end ofRNA Templates)技術(shù)建立eDNA文庫。 結(jié)果 經(jīng)改良的非連續(xù)percoll(15％、22％、30％、40％)密度梯度離心和流式細(xì)胞術(shù)分選出高純度的精子細(xì)胞，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、熒光原位雜交(FISH)、DNA含量分析進(jìn)行檢測(cè)，顯示其純度>90％。分選細(xì)胞的SY

4、BR-14的熒光強(qiáng)度顯示為單一峰，但CV>0.08。用所分選的細(xì)胞采用SMART技術(shù)構(gòu)建精子細(xì)胞cDNA文庫，原始文庫滴度為1.65x10<'6>pfu／ml，重組率為93.27％，擴(kuò)增文庫滴度為1.1x10<'9>pfu／ml，插入片段大小在0.5-2.0Kb之間，平均長度為1.0Kb。在所構(gòu)建的成人精子細(xì)胞cDNA文庫中成功擴(kuò)增出精子細(xì)胞階段特異性表達(dá)的PRM2。 結(jié)論：1．從成人正常睪丸中利用流式細(xì)胞術(shù)分離出純度為92.