以脂肪間充質干細胞為種子細胞構建組織工程脂肪的實驗研究.pdf

1、目前軟組織缺損應用的填充材料最廣泛的是固體硅膠和自體脂肪顆粒移植，其中后者由于效果好，來源豐富，無排異反應，但其吸收率高達 60-70﹪，如何克服其不足，則在每年眾多的隆乳術和軟組織填充術中，使用具有生命力的脂肪組織作填充物是最好的選擇。組織工程學的發(fā)展為其帶來新的希望。 組織工程是應用細胞生物學和工程學的原理，研究開發(fā)能夠修復，維持或改善損傷組織形態(tài)和功能的生物替代物的一門科學。組織工程化脂肪是利用組織工程技術，將具有活性的脂

2、肪細胞種植于可降解的支架上，制造出一種與受體組織相容性好、無免疫原性、有活力、耐久性長、可塑性強的人工脂肪。這種理想的脂肪具有自我修復能力，能為正在成長的患者提供增長能力，從而提高移植脂肪的長期療效。組織工程學的發(fā)展為組織帶來了新希望，同時為新型整形美容專業(yè)充填材料的開發(fā)和改進指明了方向。 組織工程技術包括：種子細胞的獲取，種子細胞均勻種植于三維支架，形成細胞一支架復合物，共同進行培養(yǎng)，組織工程脂肪的體外構建及動物在體實驗觀察，

3、本實驗將脂肪間充質干細胞經成脂誘導后種植于PLZA三維支架，形成脂肪細胞一可降解三維支架復合物，構建組織工程脂肪，并作為填充材料移植于兔背部皮下組織。在不同時間點，從大體、組織染色及掃描電鏡觀察組織工程脂肪的形成情況。 目的：1．了解體外培養(yǎng)的人脂肪間充質干細胞的生物學特性及其體外成脂和成骨的能力。2．研究低溫凍存對人脂肪間充質干細胞其生物學特性的影響，探討MSCs理想的保存方法。3．本研究在分離純化、大量擴增人脂肪問充質干細胞

4、的基礎上，通過凍存后鑒定其生物學特性有無變化，以探討這種冷凍方法的可行性。4．研究人脂肪間充質干細胞在可降解骨基質材料聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)上的黏附、增殖和分化能力，為進一步體內回植提供研究基礎。5．研究以PLGA為支架材料形成的組織工程脂肪作為軟組織填充材料的可行性。 方法：1．體外培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞并傳代計數，行成骨和成脂誘導，流式細胞儀檢測其細胞增殖周期與表面分子。2．體外分離培養(yǎng)、擴增正常成人脂肪間充質干細胞在

5、5﹪DMSO-30﹪FBS-DMEM凍存保護劑條件下，采用二步法低溫保存3月，以臺盼藍拒染回收率(TBR)、ADSCs生長曲線、ADSCs表面抗原表達以及其多向分化能力檢測，比較凍存對ADSCs生物學特性的影響。3．用常規(guī)方法體外培養(yǎng)并擴增人脂肪間充質干細胞，消化細胞并洗滌離心加入10﹪二甲基亞砜、30﹪胎牛血清、60﹪MEM的細胞凍存體系，直接放入-70﹪冰箱貯存。凍存4、8和12周在37℃水浴復溫，通過檢測細胞周期、細胞表型和成脂的

6、多向分化潛能，4．等比混合聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)，有機溶劑注模法制備PLGA。體外培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞，復合PLGA，通過掃描電鏡觀察人脂肪間充質干細胞在PLGA上的黏附、增殖，以及在成脂誘導情況下細胞形態(tài)的變化。5．實驗組：取兔的脂肪間充質干細胞，行體外擴增培養(yǎng)第3代，達到一定數量后成脂誘導1周，接種于PLGA支架上，繼續(xù)誘導 1 周，置于兔背部肩胛骨兩側皮下，分別于4、8周從大體和組織學方面觀察脂肪形成情況；對照組：

7、單純以未接種細胞的支架移植于兔背部肩胛骨兩側皮下，于相同時間點進行檢測。 結果：1．人脂肪干細胞經過體外培養(yǎng)均一的陽性表達CD44、CD106，而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表達陰性。細胞周期分析表明：G<,0>/G<,1>、S和G<,2>/M所占比例分別為79.1﹪、19.7﹪和1.3﹪。分離細胞在誘導體系下可以向成骨和成脂方向分化。2．凍存后ADSCs的增殖能力和向成骨細胞、脂肪細胞分化沒有顯著影響，與凍存前

8、比較，P>0.05。3．消化后不經過傳統(tǒng)的程序性降溫凍存技術，直接-70℃冰箱貯存，其細胞生物學特性無明顯改變，細胞仍存在成脂的多向分化潛能。4．合成的PLGA呈多孔狀，孔隙率為85﹪，孔徑為100～400 um。人脂肪間充質干細胞可在PLGA上黏附、增殖、分泌胞外基質，并可在成脂誘導劑的作用下分化為圓形的成脂樣細胞。復合后14天，人脂肪間充質干細胞和胞外基質已將基質材料顆粒完全覆蓋。 5．實驗組植入4周后該復合物在支架中有脂肪形成，并

9、可見細胞突入支架材料中；8周后支架材料繼續(xù)降解，脂肪組織形成明顯，伴有少量血管長入。對照組支架材料逐漸崩解，未見脂肪組織形成。 結論：1．脂肪間充質干細胞具有特殊的生物學特點，體外能夠向成骨和成脂方向分化。2．采用5﹪DMSO-30﹪FBS-DMEM凍存保護液和二步法的凍存體系，可較完整保持ADSCs生物學特性，是深低溫保存ADSCs的理想方案。3．人脂肪間充質干細胞懸液直接-70℃冰箱貯存不影響其生物學特性，是冷凍保存一種可行