促糖尿病潰瘍愈合細胞-材料三維復合物的研制及應用基礎研究.pdf

1、目的：本研究以天然高分子水凝膠材料作為三維細胞支架負載轉基因種子細胞，該種子細胞可高效表達血小板衍化生長因子（PDGF-BB）的中國倉鼠卵巢細胞（CHO），以構筑細胞/材料三維復合物，并應用于糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型以評價其促潰瘍愈合效果。 方法：應用轉基因技術，將rhPDGF-BB基因通過載體轉入CHO細胞，經Zeocin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達細胞系，應用細胞熒光及免疫細胞化學染色法鑒定，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linke

2、d immunosorbent assay，ELISA）檢測目的蛋白的表達量。選擇天然生物高分子材料殼聚糖經N-乙酰-L-半胱氨酸（n-acetyl-1-cysteinen，NAC）修飾后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，加去離子水合成水凝膠，應用臺盼藍排斥法及MTT法通過直接法評價水凝膠對轉基因CHO細胞的生物相容性，將該水凝膠負載轉基因CHO細胞構成細胞/材料三維復合物，分別通過大體形態(tài)、顯微鏡以及掃描電子顯微鏡觀察細

3、胞/材料三維復合物中，水凝膠材料的孔隙大小及細胞分布情況。并應用ELISA方法測定細胞/材料三維復合物培養(yǎng)基上清液中rhPDGF-BB的濃度檢測細胞/材料三維復合物PDGF釋放水平。 通過動物的全身過敏實驗、皮膚致敏實驗、皮內注射實驗及經靜脈亞急性毒理實驗，評價該水凝膠材料生物相容性。應用鏈脲佐菌素（STZ）誘導，制各糖尿病大鼠模型，并進一步在模型動物背部皮膚打孔制備糖尿病潰瘍模型，利用轉基因CHO細胞/水凝膠材料三維復合物覆蓋

4、潰瘍表面，與單純水凝膠、表皮生長因子（EGF）凝膠及空白干預對照，通過計算潰瘍愈合率及分析創(chuàng)面修復病理變化評價該轉基因細胞/水凝膠材料三維復合物促潰瘍愈合效果及免疫組化法評價肉芽組織PDGF表達情況。 結果：ELISA測定結果表明轉基因CHO細胞能夠高效表達PDGF，與殼聚糖水凝膠復合后，PDGF蛋白表達量無任何負性影響，以及臺盼藍排斥法及MTT法顯示該水凝膠材料生物相容性良好，將該水凝膠負載轉基因CHO細胞構成細胞/材料三維復

5、合物，掃描電鏡顯示其成互穿網絡結構，孔徑比較均一，細胞黏附良好。應用于糖尿病大鼠潰瘍模型后，通過與各組對照顯示安全性良好，對潰瘍愈合有顯著改善作用（P<0.05）。免疫組化結果顯示各組在不同時間PDGF表達無統(tǒng)計學顯著差異（P>0.05）。 結論：含有增強型綠色熒光蛋白的rhPDGF-BB真核表達載體，轉染CHO細胞獲得穩(wěn)定表達rhPDGF-BB蛋白的細胞系，并應用天然生物高分子水凝膠材料制備成三維細胞支架以負載轉基因種子細胞構