肌鈣蛋白I亞基NH2-末端磷酸化對心肌舒張功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、心肌肌鈣蛋白I亞基(cardiac troponin I, cTnI)在心肌收縮調(diào)節(jié)中發(fā)揮了“分子開關(guān)”的重要作用。cTnI的調(diào)節(jié)方式分為磷酸化和非磷酸化兩種。蛋白降解作為cTnI非磷酸化調(diào)節(jié)方式,可通過降解cTnI上含磷酸化的片段,達(dá)到間接去磷酸化的調(diào)節(jié)作用;或者降解其重要的結(jié)構(gòu)域,改變分子的空間構(gòu)象,達(dá)到調(diào)節(jié)心肌收縮性能的目的。本實驗室以往研究發(fā)現(xiàn)尾部懸吊模擬失重四周的大鼠心肌內(nèi)cTnI的NH2-末端降解增加,降解后的cTnI缺失了

2、PKA的磷酸化位點第23/24位絲氨酸。PKA磷酸化cTnI后可降低肌絲的Ca2+敏感性,加速Ca2+從肌絲上解離,促進(jìn)心肌舒張。PKA介導(dǎo)的cTnI磷酸化還可以提高橫橋循環(huán)速度,增加心肌無負(fù)荷收縮速度的作用。如果該磷酸化位點被去除,就有可能影響大鼠心肌收縮性能的調(diào)節(jié),特別是心肌對于β-腎上腺素能受體激動劑的反應(yīng)性。為觀察cTnI NH2-末端的降解是否會對模擬失重大鼠心臟收縮功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,我們利用離體工作心臟灌流、心肌單細(xì)胞無負(fù)荷

3、收縮功能測量、裸露肌纖維張力-pCa關(guān)系曲線測量、Western Blot和免疫組化染色等多種技術(shù),對尾部懸吊模擬失重大鼠心肌進(jìn)行多層次檢測,主要結(jié)果如下:
　　1.模擬失重大鼠的離體工作心臟對于異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)的反應(yīng)性降低。在10 mmHg的前負(fù)荷與60 mmHg的后負(fù)荷下,模擬失重組的心輸出量與對照組相比無明顯差異,但心率明顯高于對照組。ISO作用后,模擬失重組心輸出量和心率的增加低于對照組

4、。模擬失重組在基礎(chǔ)狀態(tài)下,左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)和心室內(nèi)壓力最大舒張速度(maximal rate of left ventricular pressure development,-dP/dtmax)均低于對照組。ISO灌流后LVEDP的降低和-dP/dtmax的增加程度仍顯著低于對照組。
　　2.模擬失重組心肌細(xì)胞對于β-腎上腺素能受體

5、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中幾個重要環(huán)節(jié)激動劑的反應(yīng)性降低。模擬失重組心肌細(xì)胞收縮的頻率依賴性反應(yīng)存在,但其在1 Hz、2 Hz和4 Hz頻率下的收縮幅值低于對照組。在進(jìn)行了β-腎上腺素受體激動劑ISO,腺苷酸環(huán)化酶激動劑forskolin, cAMP的模擬劑DB-cAMP和可抑制cAMP降解的IBMX等藥物灌流后,模擬失重組心肌細(xì)胞的收縮幅值仍低于對照組。在ISO,forskolin,DB-cAMP和IBMX最大濃度的作用下,模擬失重組心肌細(xì)胞收縮

6、和舒張速度的增幅低于對照組,其收縮和舒張時間的降低程度也低于對照組。
　　3. PKA磷酸化引起的裸露肌纖維Ca2+敏感性降低作用在模擬失重后受到限制。模擬失重組和對照組裸露肌纖維的Ca2+敏感性無明顯差異,使用PKA催化亞基作用后,兩組的Ca2+敏感性均發(fā)生明顯降低,但模擬失重組的降低程度低于對照組。
　　4. Western Blot結(jié)果顯示,模擬失重組和對照組心肌內(nèi)均存在cTnI的降解片段,但模擬失重組cTnI的降解片

7、段占總cTnI的比例高于對照組。模擬失重組cTnI的磷酸化水平無論在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是20 nM ISO作用后均明顯低于對照組。
　　5. Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,20 nM ISO作用前后,模擬失重組PKA活化亞基的表達(dá)水平與對照組相比均無明顯差異,ISO作用后PKA的活化增強,并且產(chǎn)生向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位,但兩組之間仍無明顯差異。
　　6. Western blot結(jié)果顯示,模擬失重組PLB的表達(dá)水平未發(fā)生改變

8、,20 nM ISO作用后第16位絲氨酸發(fā)生磷酸化的PLB占總PLB的比例與對照組相比也無明顯差異。以上結(jié)果表明,cTnI NH2-末端降解增加是模擬失重大鼠心臟舒張功能降低的一個重要影響因素。而心臟舒張功能增強受限可能會減少模擬失重大鼠的心輸出量,這可能是引起航天員在返回地面后出現(xiàn)立位耐力不良的因素之一。
　　為進(jìn)一步探討cTnI NH2-末端及其磷酸化在增強心肌舒張功能方面發(fā)揮的作用,本文還比較了異丙腎上腺素依賴性舒張功能增強

9、和頻率依賴性舒張功能增強這兩種不同的途徑在增強心臟舒張功能方面的差異。主要結(jié)果如下:
　　1.在增強離體工作心臟舒張功能的方面,ISO灌流高于單純提高刺激頻率。20 nM ISO作用后離體工作心臟的心率達(dá)到300 beats/min左右,LVEDP明顯降低,而300 beats/min的電刺激則顯著提高LVEDP。最大舒張速度-dP/dtmax在ISO和電刺激的作用下表現(xiàn)出與LVEDP類似的反應(yīng)。ISO和單純提高刺激頻率都可減少舒

10、張時間,但I(xiàn)SO減少舒張時間大于單純提高心率。在灌流不同濃度ISO時,再給予離體工作心臟較高的刺激頻率如420 beats/min后,灌流10 nM ISO的舒張時間縮短最為顯著。
　　2. ISO有利于心肌細(xì)胞舒張期Ca2+再攝取,提高心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變的峰值和靜息Ca2+濃度均隨刺激頻率提高而增加,過高的刺激頻率(＞5 Hz)反而降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變的峰值。灌流ISO后,心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變的峰值

11、明顯提高,而靜息Ca2+濃度有所下降。在灌流ISO的同時提高刺激頻率,細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度仍隨刺激頻率的提高而有所增加,但增加幅值明顯低于單純提高刺激頻率。ISO縮短細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變舒張時間大于單純提高刺激頻率。
　　3. cTnI第23/24位絲氨酸的磷酸化水平隨ISO的灌流濃度增加而顯著提高。而提高工作心臟的刺激頻率對cTnI第23/24位絲氨酸的磷酸化水平無明顯影響。
　　4. PLB第16位絲氨酸和第17位蘇氨酸

12、的磷酸化水平均隨著ISO的濃度提高而提高,但第16位絲氨酸的增加程度更為顯著。單純提高工作心臟的刺激頻率可明顯提高PLB第17位蘇氨酸的磷酸化水平,但對第16位絲氨酸的磷酸化水平無明顯影響。灌流ISO的同時提高刺激頻率,還可繼續(xù)增加PLB第17位蘇氨酸的磷酸化水平。以上結(jié)果表明,提高刺激頻率僅磷酸化PLB第17位蘇氨酸,故舒張功能增強作用較弱,而ISO同時磷酸化PLB和cTnI,使得PLB和cTnI之間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),所以對舒張功能具有更