黃酮類化合物對LPS刺激下THP-1細胞炎癥因子釋放的影響.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其發(fā)病機制尚未完全闡明，可能涉及到復雜的全身炎癥網(wǎng)絡效應、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應等多個方面，與機體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)。膿毒癥是臨床常見的急危重癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（mult

2、iple organism dysfunction syndrome, MODS）的重要原因。由于膿毒癥來勢兇猛、病情進展迅速、病死率高，給臨床救治工作帶來極大困難。所以如何早期識別、及時診斷、有效防治膿毒癥，是提高急危重癥救治成功率的關(guān)鍵。目前，已認識到全身炎癥反應是膿毒癥的病理基礎，在膿毒癥的發(fā)展過程中有著十分重要的意義。在全身感染的情況下，單核細胞受細菌毒素攻擊可釋放促炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis f

3、actor-a, TNF-a）、白介素（interleukin）-1、4、6、8等，加上其他細胞因子、補體片段、花生四烯酸衍生物、一氧化氮等的過度釋放，可造成廣泛的組織破壞。故對炎癥反應的有效干預及治療被認為是治療膿毒癥的關(guān)鍵所在。近年來，各種各樣的抗炎試驗性治療已成為探索膿毒癥防治策略的熱點。如采用血液濾過清除多種細胞因子和炎性介質(zhì)，應用烏司他丁穩(wěn)定細胞膜、抑制TNF-a/IL-1β的釋放阻斷炎癥級聯(lián)反應，均被證實取得一定的療效。但膿

4、毒癥的病死率仍然居高不下，使尋找更加有效的抗炎方案成為迫切需要。黃酮類化合物是最常見的多酚類化合物，廣泛分布于不同種類植物中。其背景膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其發(fā)病機制尚未完全闡明，可能涉及到復雜的全身炎癥網(wǎng)絡效應、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應等多

5、個方面，與機體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)。膿毒癥是臨床常見的急危重癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（multiple organism dysfunction syndrome, MODS）的重要原因。由于膿毒癥來勢兇猛、病情進展迅速、病死率高，給臨床救治工作帶來極大困難。所以如何早期識別、及時診斷、有效防治膿毒癥，是提高急危重癥救治成功率的關(guān)鍵。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）

6、誘導人白血病單核細胞株（human acute monocytic leukemia cell line, THP-1）釋放炎癥因子，模擬體內(nèi)內(nèi)毒素誘導單核細胞釋放細胞因子介導膿毒癥的炎癥過程，再利用黃酮類化合物，包括高良姜素、白楊素、異鼠李素、山奈素進行干預，了解這四種黃酮類化合物的抗炎作用，以其為膿毒癥治療提供新的治療手段。
　　目的：⑴明確高良姜素、白楊素、異鼠李素、山奈素四種黃酮類化合物對LPS刺激下THP-1細胞炎癥因子

7、釋放的影響及其抗炎特征。⑵為探索黃酮類化合物調(diào)控炎癥因子釋放的機制提供實驗基礎。
　　方法：①對THP-1細胞進行復蘇、培養(yǎng)、傳代，并用碘化丙啶（propidium iodide, PI）單染色法檢測細胞壞死率，剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng)和凍存。②以不同濃度 LPS（0ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml）刺激THP-1細胞，并在不同時間點（24h、48h）用ELISA法檢

8、測其炎癥因子白介素-6（interleukin-6, IL-6）釋放的水平及用PI單染色法檢測其細胞存活率，以得出最佳刺激濃度。③以500ng/ml的LPS刺激THP-1細胞，并同時用不同種類黃酮類化合物（高良姜素、異鼠李素、白楊素、山奈素）以不同濃度（5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l）進行干預，24小時后分別收集上清液用ELISA法檢測其炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic prot

9、ein-1, MCP-1）、TNF-a、IL-6的釋放水平。④以500ng/ml的LPS刺激 THP-1細胞，并同時用異鼠李素在不同濃度（7.5μmol/l、15μmol/l、30μmol/l、60μmol/l）干預，分別3、6、12、24小時收集細胞上清液用ELISA法檢測其炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-a的釋放水平。
　　結(jié)果：⑴以不同濃度LPS（0 ng/ml、100 ng/ml、250 ng/ml、500 ng/m

10、l、1000 ng/ml、2000 ng/ml）刺激THP-1細胞，無論是24h組還是48h組IL-6的釋放水平均較空白對照組明顯上升（P<0.05），但相同LPS刺激濃度下兩組間的IL-6釋放水平均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。⑵高良姜素、白楊素、山奈素、異鼠李素均能抑制THP-1細胞基礎狀態(tài)下IL-6、MCP-1的釋放（P<0.05）。⑶高良姜素、白楊素、山奈素對LPS誘導的THP-1細胞炎癥因子的釋放也有不同程度的影響，高良姜素在

11、從5μmol/l起抑制IL-6、TNF-a的釋放，但對MCP-1釋放的影響并無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；白楊素、山奈素也有類似的發(fā)現(xiàn)。⑷異鼠李素在7.5μmol/l時便可降低MCP-1的釋放水平（P<0.05），并呈濃度依賴性（P<0.05）。異鼠李素對MCP-1的抑制率在12小時達到高峰。⑸在對IL-6釋放水平的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在3h組中，異鼠李素從15μmol/l起呈濃度依賴性地抑制IL-6的釋放（P<0.05）；而在6、12、

12、24h組中，異鼠李素從7.5μmol/l起對IL-6的釋放水平表現(xiàn)出明顯的抑制作用，也呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性（P<0.05）。⑹在對TNF-a釋放水平的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在3h及24h組中，從15μmol/l起，隨著異鼠李素濃度的升高，TNF-a的釋放水平明顯下降（P<0.05）；在6、12h組中，異鼠李素從從7.5μmol/l起對TNF-a的釋放表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P<0.05）。異鼠李素對TNF-a的抑制率在3小時達到高峰。