鼻咽癌細(xì)胞microRNA表達(dá)譜鑒定及miR-223功能研究.pdf

1、目的:
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)南方及東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查和病因?qū)W研究顯示，鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的民族、地域和家族聚集現(xiàn)象，提示該惡性腫瘤可能是一種在某些特定環(huán)境的影響下涉及多個(gè)基因改變的遺傳性疾病。然而，迄今為止，鼻咽癌具體的分子發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、內(nèi)源性非編碼小RNA

2、，主要通過(guò)與靶mRNA的3端非翻譯區(qū)(3'-untranslated regions，3'-UTRs)結(jié)合后誘導(dǎo)靶mRNA降解或阻遏翻譯，從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后抑制特定基因的表達(dá)，在諸如細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物過(guò)程中起著基因表達(dá)調(diào)控的作用。新近的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。
　　本研究擬采用miRNA芯片篩選鼻咽癌細(xì)胞與正常鼻咽上皮細(xì)胞中表達(dá)差異的miRNA，并探討差異表達(dá)的miRNA對(duì)鼻

3、咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步探索鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制及尋找新的基因治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.利用miRNA芯片技術(shù)分析鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2和永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的miRNA表達(dá)情況，對(duì)鼻咽癌中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩查，建立鼻咽癌細(xì)胞miRNA的基因表達(dá)譜。
　　2.結(jié)合real time RT-PCR技術(shù)從中選取表達(dá)差異最明顯并可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miR-223作為我們研

4、究的靶點(diǎn)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)研究miR-223高表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2生物學(xué)特性的影響，內(nèi)容包括:
　　(1) CCK-8法檢測(cè)miR-223高表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞增殖能力的影響;
　　(2) Caspase-3法、AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)法和Hoechst33258染色法檢測(cè)miR-223高表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用;
　　(3)細(xì)胞創(chuàng)傷愈合法和Transwell小室法觀察miR-223高表達(dá)對(duì)CN

5、E2細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;
　　(4)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-223高表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞克隆形成能力影響。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞CNE1中，共檢測(cè)到290個(gè)人類miRNAs分子，與永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比較，表達(dá)差異達(dá)2倍以上的miRNA分子共有116個(gè)，其中91個(gè)上調(diào)，上調(diào)最顯著的為miR-150（524.97倍），25個(gè)下調(diào)，下調(diào)最顯著的為miR

6、-223（0.0001倍）;在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中，共檢測(cè)到300個(gè)人類miRNAs分子，與永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比較，表達(dá)差異達(dá)2倍以上的miRNA分子共有113個(gè)，其中89個(gè)上調(diào)，上調(diào)最顯著的為miR-150（341.91倍），24個(gè)下調(diào)，下調(diào)最顯著的為miR-223（0.0002倍）。
　　2.Real time RT-PCR檢測(cè)miR-223在CNE1、CNE2和NP69中的表達(dá)顯示，miR-223在NP69中表達(dá)最

7、高，其次是CNE2，再次為CNE1，結(jié)果與芯片結(jié)果基本吻合。
　　3.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染miR-223 mimic入CNE2細(xì)胞24 h后，miR-223表達(dá)增高2474.64倍。
　　4.通過(guò)上調(diào)CNE-2細(xì)胞的miR-223水平發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的生長(zhǎng)增殖活性減低，凋亡增加，侵襲及遷移能力減弱，克隆形成能力下降。
　　結(jié)論:
　　鼻咽癌細(xì)胞中存在大量異常表達(dá)的miRNA分子，這些分子可能通過(guò)調(diào)節(jié)