重組人肝再生增強因子對5-6腎切除大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型膠原表達的影響.pdf

1、目的:慢性腎衰竭(Chronic renal failare,CRY)是各種病因引起的腎臟進行性的損傷和腎功能的逐漸惡化,嚴重威脅著病人的生命。慢性腎衰竭腎臟病理表現(xiàn)為腎臟纖維化。腎臟纖維化是指腎臟對慢性損傷的病理修復過程,包括腎間質(zhì)纖維化與腎小球硬化。大量研究已證實,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積是腎小球硬化的主要病理特征。[1]ECM合成和降解的失衡是導致ECM過度沉積及腎小球功能損傷的主要

2、原因。[1、2]細胞外基質(zhì)(ECMI)積聚主要由Ⅳ型膠原構(gòu)成。國內(nèi)外大量研究結(jié)果表明Ⅳ型膠原在。腎小球內(nèi)的過度堆積是腎小球硬化的特征性病理改變。[3、4]因此,Ⅳ型膠原已被廣泛作為腎小球硬化的指標。對于ECM過度積聚,人們一直關(guān)注ECM合成的增加,近年來大量實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECM降解酶系統(tǒng)異常在此過程中同樣發(fā)揮重要作用。參與腎臟ECM降解的酶類主要有:絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)(纖溶酶原激活物-纖溶酶系統(tǒng))和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(matrix meta

3、lloproteinases,MMPs)。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實:MMPs家族是降解ECM的主要酶體系,MMPs具有鋅離子依賴性,其活化被認為是ECM降解的限速環(huán)節(jié)[5]?，F(xiàn)已證實腎小球系膜細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞、臟層及壁層上皮細胞、腎小管上皮細胞、浸潤的單核巨噬細胞和中性粒細胞等均能不同程度地表達MMP-1、2、3、7、9、10及11。MMP-9作為人體內(nèi)最重要的MMPs之一,它的主要功能是降解ECM的主要成分-Ⅳ型膠原[6]。MMPs

4、的抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases,TIMPs)能夠特異性地封閉MMPs活性。目前已發(fā)現(xiàn)4種TIMPs(TIMP-1、2、3、4),其中對TIMP-1、2研究較多。TTMP-1可與MMP-9以1:1比例不可逆結(jié)合,特異性的阻斷MMP-9的活性,在ECM積聚和降解的生理平衡中發(fā)揮重要作用。所以MMP-9表達減弱,TIMP-1表達增強,上述ECM降解效應(yīng)減弱,即能促進腎小

5、球硬化發(fā)生。已有許多學者在多種腎臟病中觀察到TIMP-1表達增[6-9]。
　　 肝再生增生強因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya等[10]首次從初斷乳大鼠肝臟中純化并克隆出的一種具有熱穩(wěn)定性的非特異性促進肝臟細胞再生的因子。近年來國內(nèi)外對ALR的研究多集中在肝臟,它可以促進肝臟再生[11]、抗肝纖維化[12、13]、抑制NK細胞活性、刺激肝癌細胞增殖等。但其mR

6、NA在肝臟、腎臟、胸腺、睪丸等組織中均有表達,充分說明了ALR具有生物功能多樣性。王愛民等[14]通過觀察hALR對肝星狀細胞基質(zhì)分解素(MMP-3)及金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)基因表達的影響,從ECM降解代謝方面探討hALR抗肝纖維化的作用機制。結(jié)果表明hALR可以促進肝星狀細胞MMP-3的基因表達,從而促進ECM的降解,發(fā)揮其抗肝纖維化作用。同時,ALR可抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原和TIMP-1在肝組織中的表達。據(jù)國內(nèi)文獻報道,A

7、LR在腎臟疾病方面的研究包括在急性腎衰竭、腎炎模型、慶大霉素損傷后的腎小管上皮細胞中的影響。已證實ALR直接或間接參與腎炎病理過程及急性腎小管損傷時刺激小管上皮細胞DNA合成等過程[15]。但目前國內(nèi)外尚缺乏ALR與慢性腎衰竭的相關(guān)報道,鑒于ALR在肝臟纖維化中可以通過金屬蛋白酶系統(tǒng)阻止肝臟纖維化的發(fā)生與進展,而金屬蛋白酶系統(tǒng)在腎臟纖維化中有重要作用。探討rhALR可否通過影響TIMP-1,MMP-9從而導致Ⅳ型膠原的產(chǎn)生發(fā)生變化,進而

8、延緩腎小球硬化,為慢性腎衰竭的防治新方法提供理論依據(jù)。
　　 本課題擬通過重組人肝再生增強因子(rhALR)對5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭模型進行干預治療,了解rhALR是否可以通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)及Ⅳ型膠原的表達部位和量,來延緩腎小球硬化。
　　 方法:
　　 將60只健康雄性SD大鼠隨機分成假手術(shù)組(S組,n=20),對照組(C組,n=20),干預

9、組(rhALR組,n=20)。C組及rhALR組大鼠行5/6腎切除,術(shù)后12周慢性腎衰竭大鼠模型制造成功,以rhALR作為干預藥物對rhALR組進行干預(200μg/kg/d),用藥1周。血生化檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值。石蠟切片行HE和Masson氏染色觀察腎小球病理改變,免疫組化測定Ⅳ型膠原,MMP-9、TIMP-1的表達,Western-blot測定MMP-9,TIMP-1的表達。結(jié)果用均數(shù)士標準差((-x)±s)

10、表示,組間差異性比較采用單因素方差分析和q檢驗,顯著性水平等于0.05,應(yīng)用SPSS13.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
　　 結(jié)果:
　　 1：血生化檢測結(jié)果提示:手術(shù)組血清Scr、BUN與假手術(shù)組(S組)相比,明顯升高(P＜0.05)。干預組(rhALR組)與對照組(C組)相比,血清Scr、BUN有顯著性差異(P＜0.05.),毒素水平下降。
　　 2：腎臟病理學結(jié)果顯示:HE染色及Masson氏染色光鏡

11、下可見C組腎小球有不同程度代償性肥大,系膜細胞及基質(zhì)增生,毛細血管塌陷,球囊粘連,可見局灶節(jié)段性硬化的腎小球。腎小管腫脹、顆粒變性、偶見灶狀萎縮,腎間質(zhì)增寬,間質(zhì)可見炎細胞浸潤,間質(zhì)纖維細胞增生明顯。與rhALR組及S組相比腎小球硬化指數(shù)差別有統(tǒng)計學意義,P值＜0.05。
　　 3：免疫組織化學結(jié)果顯示:在S組,Ⅳ型膠原在腎小球基底膜有少量表達,MMP-9主要表達于腎小管上皮細胞,少量表達于腎小球系膜細胞,TIMP-1與MMP-

12、9表達位置接近,只是量較少。在C組,可以明顯的看到Ⅳ型膠原沿腎小球基底膜深棕黃色強表達,較S組表達增多,MMP-9表達明顯少于S組,TIMP-1表達較S組增多。rhALR組各指標表達介于S與C組之間,經(jīng)軟件分析單位面積陽性染色區(qū)域平均積分光密度(MOD),rhALR組、C組與S組之間,rhALR組與C組之間統(tǒng)計學處理后差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　 4：Western blot結(jié)果顯示:于S組相比,rhALR組與C組Ⅳ

13、型膠原、TIMP-1蛋白的表達水平較高,差別有顯著意義(P＜0.05),C組Ⅳ型膠原、TIMP-1的蛋白表達水平較rhALR組高,同樣有顯著性意義(P＜0.05)。與rhALR組、C組相比,MMP-9在S組表達量最多,差異有顯著性意義(P＜0.05)。在rhALR組與C組之間,MMP-9表達在rhALR組相對較高,差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 rhALR可以通過上調(diào)MMP-9,下調(diào)TIMP-1,