殼聚糖-膠原蛋白與蛋白質(zhì)和細胞的相互作用研究.pdf

1、生物相容性評價是生物材料領(lǐng)域的關(guān)鍵科學問題之一，而細胞與材料的相互作用和蛋白質(zhì)與材料的相互作用一直是生物相容性研究的兩大主題。普遍認為生物材料植入人體后立即引起血液和細胞間液蛋白質(zhì)的吸附，然后通過蛋白質(zhì)吸附層介導細胞與材料之間的反應。因此，為了更加深入的理解材料與細胞的相互作用機制，需要對材料表面蛋白質(zhì)吸附進行全面深入的研究。
　　 本論文的目的是采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)結(jié)合生物信息學分析的方法，研究血清蛋白質(zhì)在殼聚糖膜和膠原蛋白/殼

2、聚糖混合膜表面的整體吸附情況，并結(jié)合細胞在兩種材料表面的粘附和生長情況，對吸附蛋白質(zhì)在介導細胞與材料反應中的作用進行初步的探討，為系統(tǒng)全面地研究蛋白質(zhì)吸附差異所導致的細胞行為差異機制打下基礎(chǔ)。
　　 本論文的具體工作如下:
　　 1.采用勻膠法制備殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜，對殼聚糖膜進行了臺階儀、掃描電子顯微鏡(SEM)和X射線能量散射譜分析(EDS)的表征，篩選出了殼聚糖膜制備最佳濃度;對兩種材料進行了接觸角、紅外

3、光譜和原子力顯微鏡(AFM)的表征。結(jié)果表明，膠原蛋白/殼聚糖膜比殼聚糖膜有更好的親水性;在膠原蛋白/殼聚糖膜中，膠原蛋白分子與殼聚糖分子間形成了氫鍵;膠原蛋白/殼聚糖膜表面粗糙度大于殼聚糖膜表面。
　　 2.觀察了PC12細胞在有/無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下在殼聚糖膜、膠原蛋白/殼聚糖膜和正常對照表面粘附和鋪展情況的差異，結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)（含血清）4小時后，殼聚糖膜、膠原蛋白/殼聚糖膜和正常對照表面PC12細胞均有粘附，多數(shù)細胞

4、鋪展良好，細胞多呈梭性和多角形，其中殼聚糖膜表面細胞鋪展數(shù)目較少。而采用不含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4小時后，三種材料表面PC12細胞均為圓球形，沒有很好的鋪展，說明血清對于PC12細胞的鋪展是必要的。
　　 3.采用MTT法測定了PC12細胞在殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面培養(yǎng)24h、48h和72h后的增殖率，實驗結(jié)果表明，膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細胞增殖率明顯大于殼聚糖膜表面;前者細胞增殖率隨培養(yǎng)時間延長變化不大，而后者細胞增

5、殖率呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。說明相對于單純的殼聚糖膜而言，膠原蛋白/殼聚糖膜可以明顯促進PC12細胞的生長和增殖。
　　 4.采用SDS-PAGE+質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學技術(shù)分別鑒定了兩種材料表面吸附的血清蛋白種類信息，并計算了每種蛋白質(zhì)的相對豐度，進一步利用同位素標記的方法研究兩種材料表面各種血清蛋白質(zhì)吸附量的差異。殼聚糖膜表面鑒定的蛋白質(zhì)為104種，膠原蛋白/殼聚糖膜表面鑒定的蛋白質(zhì)為98種，兩種材料表面均有吸附的蛋白質(zhì)為78

6、種;同位素標記蛋白質(zhì)組學鑒定實驗共檢測到46種蛋白質(zhì)。
　　 5.采用DAVID功能注釋工具對所有鑒定到的蛋白質(zhì)進行GO功能分類分析、蛋白質(zhì)功能分析和生物學途徑分析。GO功能分類分析結(jié)果表明蛋白質(zhì)主要包含的功能類別有生物學過程調(diào)控、應激、生物質(zhì)量調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶抑制活性、離子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、胞外空間、胞外區(qū)等。蛋白質(zhì)功能分析結(jié)果中蛋白質(zhì)涉及了26種功能類別，主要包括分泌、信號和二硫鍵蛋白質(zhì)及糖蛋白等。生物學途徑分析結(jié)果顯示，

7、殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面吸附蛋白參與的生物學途徑分別為40個和19個，其中兩者共同的途徑為16個。對粘著斑、細胞外基質(zhì)-受體反應和肌動蛋白細胞骨架調(diào)控及補體與凝血級聯(lián)反應途徑中涉及的蛋白質(zhì)進行了詳細的討論。綜合分析后，對兩種材料表面吸附的蛋白質(zhì)與細胞粘附的關(guān)系進行了初步的分析。
　　 6.采用Prosite數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)進行功能motif序列分析。包括RGD和LDV序列，分析結(jié)果表明，兩種材料表面吸附蛋白質(zhì)中共有8種結(jié)構(gòu)