硫化氫對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和致炎因子生成的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究硫化氫（Hydrogen sulfide, H2S）對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子生成的調(diào)節(jié)作用，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　以BV2細(xì)胞和原代培養(yǎng)的皮層小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，采用魚藤酮建立細(xì)胞炎癥模型。
　　采用免疫熒光方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)記物Iba-1的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q

2、-PCR）檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD68及 YM1/2的表達(dá)；MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力；采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）方法檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）、白細(xì)胞介素（Interleukin, IL）-1βmRNA水平的變化；用活性氧族物質(zhì)(Reactive oxygen species

3、, ROS)探針-雙氫乙酰乙酸-二氯熒光黃（Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量；采用Western blot測(cè)定p38的磷酸化及COX-2表達(dá)水平的變化；ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)因子前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）的生成和釋放；采用RT-PCR及Western blot法檢測(cè)胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase, CB

4、S）的表達(dá)變化；采用亞甲藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞外HS-濃度變化；采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CBS的細(xì)胞模型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MES23.5多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。
　　結(jié)果：
　　免疫熒光方法及Q-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，魚藤酮組BV2細(xì)胞Iba-1和CD68 mRNA水平顯著升高，相反地，YM1/2的mRNA下降，提示魚藤酮能夠有效激活小膠質(zhì)細(xì)胞，成功誘導(dǎo)并建立炎癥模型。與魚藤酮組相比，NaHS預(yù)處理組的Iba-1和CD68

5、mRNA水平顯著降低而YM1/2 mRNA明顯升高；MTT比色法顯示各組間細(xì)胞存活率無(wú)明顯差別。RT-PCR結(jié)果顯示，魚藤酮能促使炎癥相關(guān)因子COX-2及IL-1β mRNA水平顯著升高（P<0.01），而NaHS能夠抑制其增加（P<0.05）；DCF法顯示魚藤酮組細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高（P<0.05），而NaHS及SB203580都能夠抑制其升高（P<0.05）；Western blot法結(jié)果顯示，魚藤酮能夠促進(jìn)p38的磷酸化（P<0.

6、01），而NaHS能夠抑制其磷酸化（P<0.05）；ELISA結(jié)果顯示，魚藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中PGE2的生成和釋放增多（P<0.05），而NaHS能夠抑制其增加（P<0.05）。RT-PCR和Western blot結(jié)果一致顯示，與對(duì)照組相比，魚藤酮誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中CBS mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低；亞甲藍(lán)法顯示細(xì)胞外HS-濃度也下降，提示細(xì)胞內(nèi)硫化氫生成降低。利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CBS的細(xì)胞模型，結(jié)合Western blo

7、t，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染載體組相比，CBS過(guò)表達(dá)組魚藤酮誘導(dǎo)的p38磷酸化明顯下調(diào)（P<0.05），細(xì)胞外PGE2水平與p38的變化趨勢(shì)相一致（P<0.001）；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，魚藤酮處理的 BV2細(xì)胞條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo) MES23.5多巴胺能細(xì)胞的凋亡（P<0.01），而NaHS與處理的條件培養(yǎng)基能夠減少其凋亡（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　內(nèi)、外源性H2S均能夠抑制魚藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥相關(guān)因子的釋放，該作用