雙光子熒光顯微光學(xué)切片斷層成像方法與系統(tǒng)研究.pdf

1、腦神經(jīng)功能連接的研究已經(jīng)成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。不論是為了探索大腦的奧秘還是推進(jìn)對(duì)腦疾病的診療，在回路水平甚至全腦水平可視化神經(jīng)功能連接都是至關(guān)重要的。然而，現(xiàn)在的高精度大體積樣本熒光成像工具還很缺乏，還急需快速高精度的大熒光樣品成像方法與系統(tǒng)。
　　“工欲善其事，必先利其器”。本文針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立了一種新型的高精度大體積樣本熒光成像方法。該方法將塑性包埋技術(shù)與雙光子成像技術(shù)與相結(jié)合，經(jīng)過塑性包埋后的樣品具有良

2、好的切削性能，可實(shí)現(xiàn)高采樣精度。利用雙光子深度成像的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)成像焦面為樣品表面下一定深度，顯著降低了成像對(duì)切片質(zhì)量的影響；并結(jié)合先成像后切削的方式，保證了數(shù)據(jù)的完整性。
　　基于該方法，設(shè)計(jì)并建立了雙光子熒光顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)（Two-photon Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography,2p-fMOST）。完成了系統(tǒng)性能測(cè)試，系統(tǒng)的傳輸效率達(dá)到16.5％，物鏡后最

3、大功率達(dá)到470mW，可滿足絕大多數(shù)雙光子成像研究的需求；光學(xué)分辨率達(dá)到0.45μm（橫向）以及1.68μm（縱向），可以實(shí)現(xiàn)突起級(jí)別的神經(jīng)纖維的成像；成像范圍達(dá)到50mm×30mm×20mm，可以實(shí)現(xiàn)小鼠全腦成像；0.5μm×0.5μm×2μm體素分辨率情況下，全腦數(shù)據(jù)采集時(shí)間小于9天。為了降低系統(tǒng)調(diào)節(jié)的復(fù)雜性以及進(jìn)一步提高成像的穩(wěn)定性，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了工程化儀器設(shè)計(jì)。
　　基于2p-fMOST的成像方法與成像系統(tǒng)，以轉(zhuǎn)基因熒光小鼠

4、全腦為樣品測(cè)試了大體積熒光樣本的成像效果，獲取了轉(zhuǎn)基因熒光小鼠的高精度熒光全腦神經(jīng)連接數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集總共包括6330層光學(xué)斷層切片，數(shù)據(jù)集體素大小為0.5μm×0.5μm×2μm。數(shù)據(jù)采集過程耗時(shí)215小時(shí)。在該數(shù)據(jù)集中，可清晰分辨樹突棘以及軸突?；?p-fMOST系統(tǒng)所獲取數(shù)據(jù)集的高精度以及完整性特點(diǎn)，通過手動(dòng)追蹤的方式實(shí)現(xiàn)了全腦范圍內(nèi)單個(gè)神經(jīng)元長(zhǎng)程投射的連續(xù)追蹤，單個(gè)神經(jīng)元軸突的投射長(zhǎng)度達(dá)到12.5 mm?；?p-fMOST系統(tǒng)