大鼠心肌梗死區(qū)移植細胞長期存活及誘導(dǎo)型NOS干預(yù)研究.pdf

1、目的：通過細胞移植修復(fù)梗死心肌，誘導(dǎo)血管新生，改善心臟功能，成為當今倍受關(guān)注的課題。然而，移植細胞早期大量喪失的問題限制了其生物學功能的發(fā)揮。為此，通過動物實驗，將雄性SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植于雌性SD大鼠心肌梗死模型，觀察移植后細胞存活的數(shù)量動態(tài)變化及其分布情況，初步探討細胞移植后影響細胞長期存活的因素，在此基礎(chǔ)上，提出在眾多炎癥因子中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)激活，生成高濃度的一氧化氮，可能是影響移植細胞長期

2、存活的主要因素之一，并通過進一步的動物實驗探討心肌梗死后iNOS表達的變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，采用對照研究分析細胞移植后早期干預(yù)iNOS活性對移植細胞長期存活率的影響，為臨床應(yīng)用干細胞移植治療心肌梗死與優(yōu)化治療方案提供必要的科學依據(jù)。
　　 方法：1、急性心肌梗死(AMI)模型制備：取清潔雌性SD大鼠，體重150-180g，結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備AMI模型，1小時后進行細胞移植，隨機分組進行實驗觀察；2、骨髓間充質(zhì)干細胞(BMS

3、Cs)制備：取100～130g雄性SD大鼠，分離、純化、培養(yǎng)其BMSCs。分離純化的大鼠BMSCs經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定及免疫組化檢測；3、細胞移植：于AMI后1小時，直視下將1.2×106個培養(yǎng)的BMSCs注射植入到梗死區(qū)中心心外膜下；4、AMI后iNOS表達規(guī)律檢測：免疫印跡法檢測心肌梗死后1天、3天、7天、10天、14天梗死區(qū)的iNOS表達情況；5、移植細胞定位檢測：以Brdu或Hoechst33342標記定位觀察移植細胞，并與HE染色

4、對照；6、移植細胞定量檢測：采用Real-time PCR檢測大鼠Y染色體雄性鑒別基因sry片段的表達，作為移植細胞存活率的定量比較指標。
　　 結(jié)果：1、方法學：結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支后，左室壁變蒼白，收縮減弱，左心耳充血，與未缺血區(qū)界線清楚，表明AMI動物模型復(fù)制成功；分離純化的大鼠BMSCs經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定為CD44+/CD34-，免疫組化檢測有CD44表達，而無CD34表達，證明擬移植細胞為BMSCs。2、移植后不同時

5、間的細胞存活觀察：依據(jù)細胞移植后取材時間分為3組：一周組—細胞移植后1周取材；三周組—細胞移植后3周取材；六周組—細胞移植后6周取材。各組組織冰凍切片熒光顯微鏡下均可觀察到大量Hoechst33342標記陽性細胞，三周組、六周組可見標記細胞部分聚集形成血管樣結(jié)構(gòu)；各組HE染色和Brdu免疫組織化學檢測均可見有核呈棕色的陽性標記細胞集中分布；Real-time PCR檢測六周組細胞存活率(8.73％)，一周組(7.88％)，三周組(7.8

6、2％)(n=8，p＞0.05)，提示移植后一周至六周移植細胞不再有進行性減少。3、AMI后不同時間心肌組織iNOS表達規(guī)律：AMI后不同時間點iNOS表達的強度變化規(guī)律為：3天＞1天＞7天＞10天＞14天(n=6，p＜0.05)，提示在第1至3天為iNOS表達高峰。4、選擇性iNOS抑制劑對移植細胞長期存活的保護作用：實驗組于移植后12h給予選擇性iNOS抑制劑1400W，2mg/kg，腹腔注射，2次/天，維持4天，細胞移植后6周取材；

7、對照組給予等量生理鹽水，其余同實驗組。結(jié)果可見干預(yù)iNOS活性的實驗組中Brdu標記陽性細胞分布集中，周邊未標記的炎癥細胞明顯減少，部分血管內(nèi)皮上明顯可見Brdu標記陽性細胞。相鄰切片、相同部位的HE染色可見移植細胞的相似分布，核呈藍紫色，核大，染色深。Real-time PCR檢測顯示實驗組和對照組Y染色體sry序列的表達水平分別為8.75％、6.63％，提示抑制iNOS活性可明顯增加移植細胞存活率(n=7，p＜0.05)。