蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究.pdf

1、目的：蛋白酶激活受體-2(Proteinase-actived receptors2， PAR-2)是一種細(xì)胞膜表面受體，為G蛋白相耦聯(lián)的蛋白酶激活受體超家族成員之一。PAR-2在各個(gè)系統(tǒng)及組織中廣泛表達(dá)，胰蛋白酶、纖溶酶、凝血因子VIIa和Xa等是其內(nèi)源性激活肽，也可被人工合成的PAR-2選擇性激動(dòng)劑SLIGKV-NH2激活。國內(nèi)外大量研究表明，PAR-2與消化系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)，表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常組織細(xì)胞，可促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)

2、移。胰腺癌是預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于它的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率，手術(shù)治療難度大，且淋巴轉(zhuǎn)移迅速，發(fā)病率幾乎等于死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，PAR-2在胰腺癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)多種胰腺癌細(xì)胞的增殖，還可加速裸鼠皮下移植胰腺腫瘤的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。正常胰腺腺泡和胰腺癌細(xì)胞均可可分泌胰蛋白酶原，胰蛋白酶原激活后成為胰蛋白酶，而胰蛋白酶卻是PAR-2最有效的激動(dòng)劑，說明PAR-2很可能與胰腺癌有著密切的關(guān)系。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)于PAR-2促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)

3、移機(jī)制的研究鮮見報(bào)道，而PAR-2促進(jìn)胰腺癌血管生成和淋巴轉(zhuǎn)移方面的研究大多還處于在體研究階段。本研究我們采用侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990為靶細(xì)胞，初步探討PAR-2促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能的分子機(jī)制。
　　 方法：RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)SW1990細(xì)胞中PAR-2mRNA及蛋白的表達(dá)情況。繪制SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MTT法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV作用前后SW1990細(xì)胞增

4、殖情況，并確定合適的各藥物濃度和作用時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布。Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲和遷移能力。RT-PCR法檢測(cè)胰藥物作用前后MMP-2、MMP-9、VEGF-A、VEGF-C、IL-8mRNA表達(dá)的變化。明膠酶譜法檢測(cè)胰蛋白酶和SLIGKV作用細(xì)胞前后MMP-2、MMP-9明膠酶活性的變化。ELISA法檢測(cè)藥物干預(yù)SW1990細(xì)胞8h、16h、24h、32h后分別收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液，檢

5、測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的各個(gè)時(shí)間段上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8的蛋白含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 PAR-2在胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 1 RT-PCR法檢測(cè)PAR-2 mRNA表達(dá)：結(jié)果顯示SW1990細(xì)胞在基因水平表達(dá)PAR-2。且發(fā)現(xiàn)PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV及胰蛋白酶作用SW1990細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn)，PAR-2mRNA表達(dá)量分別為（0.645±0.038）、(0.612±0

6、.042)vs對(duì)照組(0.391±0.022)顯著增高(P＜0.05)，但PAR-2反激動(dòng)肽VKGILS組PAR-2mRNA表達(dá)量為（0.413±0.040），與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示，SW1990細(xì)胞與抗PAR-2多克隆抗體有很強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。PAR-2蛋白表現(xiàn)為棕黃色，著色主要在胞膜和胞漿，與PAR-2在細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)相符合。
　　 PAR-2激動(dòng)劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞

7、SW1990增殖的影響
　　 1細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)及MTT法檢測(cè)PAR-2激活后對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定時(shí)間范圍內(nèi)，SLIGKV在1-50μmol/L、胰蛋白酶在1-10nmol/L濃度范圍內(nèi)胰腺癌細(xì)胞的增殖與藥物濃度呈正相關(guān)。當(dāng)藥物濃度一定時(shí)，在1-56h時(shí)間范圍內(nèi)，胰腺癌細(xì)胞增殖與作用時(shí)間也呈正相關(guān)，且呈時(shí)間依賴性。而VKGILS始終對(duì)SW1990細(xì)胞增殖則無明顯影響。
　　 2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

8、變化：10nmol/L濃度的胰蛋白酶及50umol/LSLIGKV組促進(jìn)SW1990細(xì)胞細(xì)胞周期比例重新分布，加速細(xì)胞周期，其中使S期和G2/M細(xì)胞增多、使G0/G1細(xì)胞減少，對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05）。而VKGILS無此作用。
　　 PAR-2激動(dòng)劑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞SW1990侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　 1 Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)SW1990細(xì)胞侵襲及遷移能力：在遷移試驗(yàn)中，一定濃度的胰蛋白酶及SLIGKV作用

9、相同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，SW1990細(xì)胞經(jīng)變形運(yùn)動(dòng)通過微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組與反激動(dòng)肽組(100.8±12.9)(89.6±10.9)vs(43.3±9.2)(50.1±7.5)，（P＜0.01）。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后SW1990細(xì)胞降解Matrigel基質(zhì)膠，進(jìn)入微孔膜內(nèi)的細(xì)胞數(shù)胰蛋白酶及SLIGKV也顯著高于對(duì)照組及VKGILS組，(81.5±8.1)(71.7±5.2)vs(28.3±5.6)(32.2±7.8)，(P＜0.

10、01)。
　　 2 RT-PCR10nmol/L的胰蛋白酶及50nmol/L的SLIGKV作用24h后檢測(cè)細(xì)胞MMP-2、VEGF-A、VEGF-C、IL-8mRNA的表達(dá)量分別明顯高于對(duì)照組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而MMP-9表達(dá)無明顯變化。
　　 3 明膠酶譜檢測(cè)MMP-2、MMP-9的明膠酶活性變化：結(jié)果顯示一定濃度的胰蛋白酶及SLIGKV作用后細(xì)胞MMP-2活性明顯高于對(duì)照組及反激動(dòng)肽組(0.921±0.032)(

11、0.712±0.024)vs(0.310±0.038)(0.378±0.029)，(P＜0.01)，而MMP-9的活性無明顯變化，這與RT-PCR結(jié)果一致，（P＞0.05）。
　　 4 ELISA法檢測(cè)藥物干預(yù)8h，16h，24h，32h后，收集各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)胰蛋白酶組及SLIGKV組三者蛋白含量均高于對(duì)照組，（P＜0.05），且呈一定的時(shí)間依賴性。

12、　　 結(jié)論：
　　 1 胰腺癌細(xì)胞SW1990在基因及蛋白水平均表達(dá)PAR-2受體，且PAR-2激動(dòng)劑可在基因水平上調(diào)其表達(dá)。
　　 2 PAR-2激動(dòng)劑可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖，在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度一時(shí)間依賴性，并且其促增殖作用和加速細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)。
　　 3 PAR-2激動(dòng)劑可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞SW1990浸潤(rùn)和遷移，可能與上調(diào)細(xì)胞MMP-2mRNA表達(dá)，增強(qiáng)MMP-2明膠酶活性有關(guān)，而與M