人脂肪干細胞高成骨潛能亞群分離鑒定的初步實驗研究.pdf

1、目的:以骨形態(tài)發(fā)生蛋2（bone morphogenetic protein2, BMP2）特異的IA型受體（bone morphogenetic protein receptor IA, BMPR-IA）為標記分子，在人脂肪干細胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）中分離鑒定具有高成骨潛能的亞群細胞，初步建立穩(wěn)定有效的人ADSCs高成骨亞群純化技術(shù)。
　　方法:利用整形外科手術(shù)中廢棄的脂肪組織分

2、離獲取人ADSCs，流式細胞技術(shù)檢測其表面干細胞特異的標記分子CD90和CD105的表達水平。體外成骨誘導(dǎo)，通過堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、茜素紅染色和RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALP、OPN、Col-I、Runx2/Cbfa1及Osterix等的表達評估人ADSCs的分化成骨能力。利用流式細胞技術(shù)檢測BMPR-IA在人ADSCs原代、傳代培養(yǎng)及體外成骨誘導(dǎo)早期的表達水平，然后以BMPR-IA為

3、標記分子，在人ADSCs中分選得到BMPR-IA陽性和陰性表達的兩類亞群細胞。分別進行體外成骨誘導(dǎo)，通過ALP染色和茜素紅染色比較兩類細胞體外成骨能力差異，鑒別成骨能力強的亞群細胞。
　　結(jié)果：人ASDCs細胞表面高表達CD90（44.5％）和CD105（93.9%）。誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，誘導(dǎo)組的ALP染色陽性水平明顯高于對照組，14天后茜素紅染色觀察到細胞外散在的鈣基質(zhì)的沉積，隨誘導(dǎo)時間延長，鈣沉積的范圍和程度逐漸增大，到28天時胞

4、外已沉積大量鈣化基質(zhì)。RT-PCR檢測到人ADSCs成骨誘導(dǎo)14天后成骨相關(guān)基因OPN、Col-I、Runx2/Cbfa1和Osterix等的表達。新鮮分離的人ADSCs中BMPR-IA陽性表達率為11.5%，傳代培養(yǎng)后維持在8.7%左右；人ADSCs誘導(dǎo)成骨的早期BMPR-IA的表達維持在8.6%左右。BMPR-IA（+）亞群細胞體外成骨誘導(dǎo)7天后，ALP染色未見明顯陽性著色；14天后，茜素紅染色亦未見細胞外鈣基質(zhì)的沉積。