PI3K-Akt-GSK-3β和線粒體ATP敏感鉀通道介導原花青素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、隨著靜脈溶栓、經皮冠狀動脈脈介入術、冠狀動脈旁路移植術在臨床的廣泛應用，越來越多的醫(yī)生和科研工作者意識到心肌缺血再灌注損傷的重要性。盡早、持續(xù)、充分的開通梗死相關血管，恢復缺血心肌的血液灌注，搶救瀕臨死亡的心肌是缺血性心臟病、急性心肌梗死最重要的治療原則。但是，再灌注治療是把“雙刃劍”，在恢復冠脈血流的同時加重組織損傷，出現心功能不全、心律失常、心肌梗死面積擴大等嚴重現象。因此找到有效的減輕缺血再灌注損傷的方法是非常重要的課題。許多研究

2、發(fā)現缺血預適應、藥物預適應是抗心肌缺血再灌注損傷有效方法，可以誘導釋放內源性活性物質，并通過機體內源性的機制如蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶、線粒體ATP敏感鉀通道而發(fā)揮保護作用。
　　 心肌的缺血再灌注損傷是一個極其復雜的病理生理過程，目前公認的主要致病機制包括:氧化應激損傷、細胞內鈣超載、細胞凋亡、細胞能量喪失，中性粒細胞炎癥反應激活等。同時缺血再灌注損傷涉及到機體內很多調控機制和信號通路的激活和失活?；钚匝踉谌毖俟嘧⑦^

3、程中大量產生，具有很強的化學活性，活躍的電子很容易與細胞的組成物質發(fā)生反應，使細胞膜脂質過氧化增強，抑制蛋白質的功能并且破壞核酸及染色體，從而破壞細胞的結構和功能。細胞凋亡是連續(xù)性程序化細胞死亡，在整個過程中涉及到一系列特殊基因和蛋白的表達，細胞發(fā)生特征性的形態(tài)學和生化變化。凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。抑制心肌細胞凋亡可明顯縮小心肌梗死的面積。磷脂酰肌醇-3激酶和其下游的蛋白激酶B(Akt)通路是細胞內重要

4、的信號轉導通路，在細胞的凋亡、存活，以及增殖等活動中發(fā)揮重要的生物學功能。大量的研究表明，藥物預處理可以激活心肌細胞內的P13K/Akt信號通路，在心肌缺血再灌注損傷的保護中起決定性的作用。線粒體ATP敏感鉀通道也參與缺血再灌注損傷，線粒體ATP敏感鉀通道開放劑可以發(fā)揮缺血預處理保護作用，而該通道的抑制劑可以阻斷缺血預處理的心肌保護作用。線粒體ATP敏感鉀通道存在于線粒體內膜，KATP通道開放調節(jié)鉀離子活動，維持線粒體容積，減少缺血期細

5、胞鈣超載和再灌注期活性氧的大量生成，從而發(fā)揮心肌保護作用。
　　 原花青素是從葡萄籽中提取的一類多酚化合物，具有極強的抗氧化活性，前期的研究發(fā)現原花青素有抗氧化、調節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用，但原花青素對心肌缺血再灌注損傷是否有保護作用以及內在的機制尚不明確。本實驗通過大鼠缺血再灌注損傷模型和離體乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷模型，從器官、細胞、分子水平研究原花青素對心肌缺血再灌注損傷的作用和作用機理。
　　 第一部分

6、原花青素減輕心肌缺血再灌注損傷的研究
　　 目的:通過建立在體大鼠急性心肌缺血再灌注模型，觀察原花青素對心臟收縮舒張功能、心肌酶CK-MB和CTnⅠ水平、心肌梗死面積的影響。同時利用PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002，驗證PI3K/Akt信號通路是否在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。
　　 方法:取雄性SD大鼠隨機分為假手術組(SO組)、缺血再灌注組(I/R組)、原花青素組(PC組)、LY294004阻斷組（

7、LY294002組）共四組。PC組和LY294002組大鼠進行PC溶液灌胃，每天250mg/kg，共4周。SO組和I/R組的大鼠每天用相同體積的生理鹽水灌胃，共4周。末次給藥24h內，構建大鼠在體心肌缺血再灌注模型。SO組只開胸置縫線而不結扎，I/R組、PC組和LY294002組動物均開胸手術結扎冠狀動脈左前降支30分鐘，松開結扎線120min，建立急性心肌缺血再灌注損傷模型。LY294004組于缺血前10min頸靜脈注射LY29400

8、2。分別于左冠狀動脈前降支結扎前(To)、心肌缺血30 min(T1)、再灌注30min(T2)、再灌注1h(T3)、再灌注2h(T4)時測定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVDEP)、左室內壓上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)。再灌注2h后測血清肌酸磷酸激酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ的水平，用伊文思藍和氯化三苯四唑啉染色法測定心肌梗死面積。
　　 結果:1、各組大鼠心臟收縮舒張功能比較:各組大鼠缺血前LVSP

9、、LVEDP、±dp/dtmax的基礎值比較，差異無統(tǒng)計學意義。SO組各指標在各個時間點的變化無統(tǒng)計學意義。除SO組外，各組的LVSP、±dp/dtmax均逐漸下降，再灌注2h與缺血前比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各組的LVEDP均逐漸升高，再灌注2h與缺血前比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與SO組比較，I/R組LVSP、±dp/dtmax降低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);LVEDP升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與I/R組

10、比較，PC組LVSP、±dp/dtmax升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);LVEDP減低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PC組比較，LY294002組LVSP、±dp/dtmax降低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); LVEDP升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。LY294002組與I/R組的指標比較無差異。
　　 2、各組血清CK-MB和CTn1的比較:與SO組比較，I/R組CK-MB和CTn1升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

11、1);與I/R組比較，PC組CK-MB和cTn1降低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與PC組比較，LY294002組CK-MB和cTn1升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);LY294002組與I/R組比較無統(tǒng)計學意義。
　　 3.各組大鼠心肌梗死、缺血范圍的比較:與SO組(0)比較，I/R組(38.6±2.7％)心肌梗死面積顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與I/R組比較，PC組(15.2±2.2％)心肌梗死面積降低，有統(tǒng)

12、計學意義(P＜0.01);與PC組比較，LY294002組(30.3±2.4％)心肌梗死面積升高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。LY294002組與I/R組比較無統(tǒng)計學意義。除SO組外，各組心肌缺血面積差異無統(tǒng)計學差異。
　　 結論:1、心肌缺血再灌注損傷表現為心臟收縮舒張功能下降、心肌組織嚴重壞死。2、原花青素對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用，可以改善心臟收縮舒張功能，減少心肌酶水平，減少心肌梗死面積。3、阻斷PI3K/Ak

13、t信號通路后，原花青素的心臟保護作用消失，原花青素的心肌缺血再灌注保護作用與PI3K/Akt信號通路激活有關。
　　 第二部分 PI3K/Akt/GSK-3β和線粒體ATP敏感鉀通道在心肌細胞缺氧復氧損傷中的作用機制
　　 目的:以原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞為研究對象，建立心肌細胞缺氧/復氧(Anoxia/Reoxygenation，A/R)損傷模型，在細胞水平模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察原花青素預處理對心肌細胞生存率、

14、活性氧水平、凋亡的影響，探討原花青素對心肌細胞缺氧復氧損傷的作用機制;同時應用PI3K/Akt信號轉導通路抑制劑LY294002和線粒體ATP敏感鉀通道抑制劑5-羥葵酸，從分子水平闡明PI3K/Akt/GSK-3β通路和線粒體ATP敏感鉀通道與原花青素心肌保護作用的關系。
　　 方法:實驗用SD新生大鼠(1-3d)，無菌取出乳鼠心臟，經分離附著組織，胰蛋白酶消化，差速貼壁法純化制成心肌細胞，以1×106/cm2的細胞密度接種于培

15、養(yǎng)皿。在培養(yǎng)48h后隨機分為5組:正常對照組(Control組);缺氧/復氧組(A/R組):細胞行缺血3h復氧3h;原花青素預處理+A/R組(PC組):細胞缺氧前加入100ug/ml原花青素預作用30min，再行缺氧復氧;LY294002+PC+A/R組(LY294002組):培養(yǎng)基中加入濃度為15umol/l的LY294002，30min后加原花青素，30min后再行缺氧復氧;;5-HD+PC+A/R組（5-HD組）:培養(yǎng)基中加入濃度

16、為100umol/L的5-HD，30min后加原花青素，30min后再行缺氧復氧。檢測以下指標:細胞存活率(MTT法);細胞核Hoeehst33258染色;心肌細胞的ROS水平;Tunel檢測細胞凋亡、流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率;Western blot法檢測心肌細胞內Caspase-3、Akt、磷酸化Akt、GSK—3β、磷酸化GSK—3β的表達水平。
　　 結果:1、心肌細胞培養(yǎng)結果
　　 倒置顯微鏡下觀察:細胞呈

17、放射狀，漩渦狀，細胞核呈橢圓形，多數居中，細胞呈片狀有節(jié)律搏動。
　　 2、各處理組心肌細胞存活率
　　 A/R組(41.51±3.86％)心肌細胞嚴重受損，細胞存活率明顯降低，與Control組(92.36±3.12％)相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);PC組(75.74±4.69％)與A/R組相比細胞存活率升高，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01); LY294002組(47.52±4.71％)與PC組相比細胞存

18、活率降低，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比，無統(tǒng)計學意義;5-HD組(48.13±4.68％)與PC組相比細胞存活率降低，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比，兩者差異無統(tǒng)計學意義;LY294002組、5-HD組相比兩者差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3、Hoechst33258染色觀察細胞核的改變:
　　 control組細胞核為圓形且熒光強度較弱，缺氧復氧誘導心肌細胞核固縮、核破裂，可見

19、強的藍色熒光，且不均勻，強藍染的細胞明顯增多。PC組強藍染的細胞較缺氧復氧組減少。LY294002組、5-HD組細胞的改變同缺氧復氧組相似。
　　 4、各處理組心肌細胞的ROS水平
　　 A/R組（熒光強度為211.6±38.4）與Control組(27.0±5.6)相比細胞的ROS增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); PC組(80.1±10.3)與A/R組相比細胞的ROS水平減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.

20、01);LY294002組(167.2±18.3)與PC組相比細胞的ROS水平增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比，兩者差異無統(tǒng)計學意義;5-HD組(178.3±22.8)與PC組相比細胞的ROS水平增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比無統(tǒng)計學差異;LY294002組、5-HD組相比差異無統(tǒng)計學差異。
　　 5、Tunel檢測細胞凋亡
　　 A/R組(25.3±2.64％)與C

21、ontrol組(3.1±0.65％)相比細胞凋亡指數明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); PC組(10.2±1.59％)與A/R組相比細胞凋亡減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01); LY294002組(19.6+1.79％)與PC組相比細胞凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比，無統(tǒng)計學差異;5-HD組(18.1±2.03％)與PC組相比細胞凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/

22、R組相比無統(tǒng)計學差異;LY294002組、5-HD組相比細胞凋亡無統(tǒng)計學差異。
　　 6、流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡水平
　　 應用流式細胞儀進行Annexin V/PI雙染色對細胞的凋亡水平進行分析測定。Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，位于十字象限的右下方。 A/R組(30.71％±3.82％)與Control組(8.36±1.25％)相比凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);PC組(13.11

23、±1.36％)與A/R組相比細胞凋亡減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);LY294002組(26.12±2.07％)與PC組相比凋亡明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比無統(tǒng)計學差異;5-HD組(27.47±2.15％)與PC組相比凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比無統(tǒng)計學差異;LY294002組、5-HD組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 7、Western blotting

24、分析Caspase-3、t-Akt、p-Akt、t-GSK-3β、p-GSK-3β的表達水平。
　　 心肌細胞Caspase-3蛋白表達水平:Caspase-3蛋白表達水平可以反映心肌細胞凋亡的程度，Caspase-3蛋白表達高，則凋亡的心肌細胞多，反之，Caspase-3蛋白表達低，則凋亡的心肌細胞少。A/R組與Control組相比，Caspase-3蛋白表達增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); PC組與A/R組相比C

25、aspase-3蛋白表達減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01); LY294002組與PC組相比Caspase-3蛋白增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比無統(tǒng)計學差異;5-HD組與PC組相比Caspase-3蛋白增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與A/R組相比無統(tǒng)計學差異;LY294002組、5-HD組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 心肌細胞t-Akt、p-Akt蛋白水平:A/R組與Control組

26、相比，p-Akt蛋白表達略增加，兩者差異無統(tǒng)計學意義;PC組與A/R組相比p-Akt蛋白表達明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);LY294002組與PC組相比p-Akt蛋白表達明顯減低，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);5-HD組與LY294002組相比p-Akt蛋白表達升高，有顯著性差異(p＜0.01)，與PC組相比無統(tǒng)計學差異。而t-Akt蛋白表達水平在各組無統(tǒng)計學差異，說明是p-Akt發(fā)揮作用。
　　 心肌

27、細胞t-GSK-3β、p-GSK-3β的表達水平:A/R組與Control組相比，p-GSK-3β蛋白表達略增加，兩者無統(tǒng)計學差異;PC組與A/R組相比p-GSK-3β蛋白表達明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01); LY294002組與PC組相比p-GSK-3β蛋白表達明顯減低，兩者差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);5-HD組與LY294002組相比p-GSK-3β蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，與原花青素組相

28、比無統(tǒng)計學差異。而t-GSK-3β蛋白表達水平存各組無統(tǒng)計學差異，說明是p-GSK-3β發(fā)揮作用。
　　 結論:1、從細胞水平證明了原花青素預處理對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用，表現為提高細胞生存率、減少活性氧水平、減少細胞凋亡。
　　 2、加入PI3K阻斷劑LY294002后原花青素的保護作用消失，說明細胞內P13K/Ak/GSK-3β信號轉導通路參與原花青素預處理心肌缺血再灌注損傷保護作用。