骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞自體移植治療冠心病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是胚胎發(fā)育早期參與血管發(fā)生(Vasculogenesis)的最重要的干細(xì)胞。由于EPCs具有活躍的分化增生能力和不依賴(lài)于血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的成血管能力，因此可作為干細(xì)胞移植促血管新生治療的一種理想的細(xì)胞供體。尤其對(duì)于老年、糖尿病、高脂血癥等由于ECs功能受損而對(duì)細(xì)胞/生長(zhǎng)因子反應(yīng)低下的患者而言，其治療價(jià)值更為突出。但EPCs移植是一種個(gè)體化治療，細(xì)胞來(lái)源較少，即使通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得的數(shù)量亦有限

2、，因此通過(guò)體外干預(yù)方法促進(jìn)EPCs的生物學(xué)活性是提高其治療效能的關(guān)鍵手段。最新研究認(rèn)為，微環(huán)境對(duì)于決定干細(xì)胞的命運(yùn)比干細(xì)胞本身更重要[1]，微環(huán)境改變對(duì)干細(xì)胞的定向分化可能起到關(guān)鍵性作用，但同時(shí)也可能對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和功能產(chǎn)生負(fù)面影響，這種“雙面”效應(yīng)尚未引起研究者的足夠重視。還有的研究提示，心臟中存在固有的多能干細(xì)胞，并可能參與心臟損傷后的修復(fù)[2.3]，缺血再灌注條件下移植的EPCs和心臟固有的多能干細(xì)胞面臨著不同程度的缺血再灌注

3、損傷(IRI)，在該條件下的EPCs自體移植面臨移植時(shí)機(jī)選擇，EPCs預(yù)處理，以及EPCs移植后的在體標(biāo)記觀察等急需解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)旨在明確EPCs貼壁篩選方法的差異，結(jié)合以往研究報(bào)道美托洛爾可促進(jìn)EPCs分泌VEGF，VEGFR表達(dá)上調(diào)；小腸RNA可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和對(duì)機(jī)體損傷有一定的保護(hù)作用，通過(guò)觀察美托洛爾和小腸RNA對(duì)IRI條件下EPCs的增殖、分泌功能、生物學(xué)特征表達(dá)等方面的影響，探討其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用EPCs移植前的預(yù)

4、處理提供理論依據(jù)，并進(jìn)行超順磁性氧化鐵顆粒(SPIO)標(biāo)記EPCs，為EPCs移植后的活體示蹤研究和移植效果評(píng)價(jià)開(kāi)創(chuàng)新方法。 實(shí)驗(yàn)方法:(1)分別取小型豬和家兔骨髓，以Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)。采用加入豬重組VEGF和bFGF的EPCs專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代。對(duì)傳代細(xì)胞采用FACS分別標(biāo)記抗CD133+、Ⅷ因子、CD31+及VEGFR-2。并檢測(cè)細(xì)胞分泌功能和增殖情況。(2)平行對(duì)照觀察24h貼壁和不貼

5、壁細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的EPCs細(xì)胞增殖能力、分泌功能，生物學(xué)標(biāo)志表達(dá)情況。(3)給予美托洛爾和小腸RNA，運(yùn)用缺血模擬液模擬體內(nèi)缺血再灌注情況，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MTT，分泌功能，WesternBlotting等變化，觀察EPCs對(duì)缺血再灌注的耐受性，評(píng)價(jià)其干預(yù)效應(yīng)。(4)建立急性心肌梗死動(dòng)物模型：對(duì)提供骨髓的家兔，在其EPCs純化培養(yǎng)成功后開(kāi)胸暴露心臟，結(jié)扎前降支第二對(duì)角支開(kāi)口下0.5mm處，造成急性心肌梗死模型。(5)體外用SPIO標(biāo)記

6、EPCs，觀察理想的標(biāo)記濃度、成像效果、標(biāo)記持續(xù)時(shí)間及標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響等。(6)用SPIO標(biāo)記EPCs24h后，開(kāi)胸于心肌梗死區(qū)域迷路注射EPCs，并通過(guò)核磁成像的方法在活體動(dòng)態(tài)觀察移植后的變化，心電圖、B超、病理組織學(xué)檢查等方法評(píng)價(jià)移植效果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)2種貼壁篩選方法均可以培養(yǎng)出EPCs。但經(jīng)免疫熒光染色鑒定及生物學(xué)特征等辨別，24h未貼壁細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后獲得的EPCs純度、成熟度、細(xì)胞功能和數(shù)量均優(yōu)于24h貼壁組和4

7、8h未貼壁組。(2)EPCs對(duì)缺血的耐受極限大約在3～4h；美托洛爾作用于EPCs的有效濃度約在1×10-6mol/ml左右；美托洛爾預(yù)處理組EPCs的Flk-1水平上調(diào)，EPCs凋亡較少，LDH和iNOS生成明顯低于單純?nèi)毖俟嘧⒔M和缺血再灌注后添加美托洛爾組，但高于正常對(duì)照組和單純美托洛爾處理組。(3)小腸RNA作用于EPCs的有效濃度約在20μg/ml左右，小腸RNA預(yù)處理可以上調(diào)EPCs的Flk-1，減少EPCs凋亡和LDH和i

8、NOS的生成。(4)缺血再灌注后即刻添加美托洛爾或小腸RNA反而對(duì)EPCs生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生不利的影響，尤其是RNA組。(5)SPIO體外標(biāo)記EPCs的安全濃度大約在100μgFe/ml以下；高于此濃度，雖然成像效果更好，但會(huì)影響EPCs的正常增殖生長(zhǎng)。較理想的標(biāo)記濃度約在50μgFe/ml左右。體外標(biāo)記成像可以持續(xù)4周以上。(6)EPCs的自體移植可以有效地促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，縮小心肌梗死區(qū)域，促進(jìn)梗死區(qū)新血管形成。 結(jié)論:選擇24h

9、未貼壁細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化可以獲得純度、成熟度較高，細(xì)胞功能較好的EPCs細(xì)胞群，而24h內(nèi)貼壁細(xì)胞更趨向于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞群，具有多向分化能力。對(duì)缺血的心肌和移植后再次缺血區(qū)域應(yīng)在4h內(nèi)進(jìn)行血流恢復(fù)，最大限度保護(hù)固有的多能干細(xì)胞和移植的EPCs。美托洛爾和小腸RNA預(yù)處理可以通過(guò)有效增強(qiáng)EPCs的VEGF和Flk-1表達(dá)，減少I(mǎi)RI條件下的細(xì)胞凋亡等機(jī)制對(duì)EPCs起到保護(hù)和促進(jìn)增殖的作用，但不宜在缺血再灌注后即刻添加。EPCs自體移植可以