沉默SP1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞PIWIL1表達(dá)及其啟動(dòng)子活性的影響.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞（BGC-823）sp1基因的表達(dá)，探索其對(duì)PIWIL1在mRNA及蛋白水平表達(dá)及其啟動(dòng)子活性的影響，為進(jìn)一步探索PIWIL1在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將不同劑量的SP1-siRNA通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC-823，通過Western印跡檢驗(yàn)SP1-siRNA的干擾效率，篩選出SP1 si RNA的發(fā)揮最佳干擾效率時(shí)si RN

2、A的濃度。
　　2.將不同劑量的SP1-siRNA(0，40nM)通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC-823，通過WB技術(shù)研究PIWIL1蛋白的表達(dá)變化。
　　3.將不同劑量的SP1-siRNA(0，40nM)通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC-823，通過RT-PCR技術(shù)研究PIWIL1 mRNA的表達(dá)變化。
　　4.將不同劑量SP1-siRNA(0，40nM)與PIWIL1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)BGC-823

3、細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)SP1對(duì)PIWIL1轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。分析方法采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的兩兩比較，并以雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)Western印跡結(jié)果，通過Quantity one軟件進(jìn)行分析，同時(shí)考慮到節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材，選擇SP1-siRNA終濃度為40 nM時(shí)可達(dá)到最佳干擾效果。
　　

4、2.根據(jù)Western印跡結(jié)果，通過Quantity one軟件進(jìn)行分析，干擾胃癌細(xì)胞BGC-823 SP1表達(dá)后，PIWIL1蛋白的表達(dá)也隨之下降，從而說明，在蛋白水平上PIWIL1的表達(dá)與SP1的表達(dá)有相關(guān)性，且有可能是正相關(guān)的關(guān)系。
　　3.根據(jù)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，干擾胃癌細(xì)胞BGC-823 SP1表達(dá)后，PIWlL1 mRNA表達(dá)也隨之下降，從而說明，在基因水平上PIWlL1的表達(dá)與SP1的表達(dá)有相關(guān)性，且有可能是正相關(guān)

5、的關(guān)系。
　　4.不同劑量的SP1-siRNA、 PIWlL1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體PGL3-Basic-PIWIL1(-266/-23)、PGL3Basic-PlWIL1(-1304/-23)及內(nèi)參照質(zhì)粒PRL-TK成功共轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)各組PIWIL1活性變化，經(jīng)LSD-t法檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000，P=0.000），顯示了SP1沉默后可明顯下調(diào)PIWIL1的核心啟動(dòng)子的