（一）豬鼻支原體免疫膠體金快速檢測(cè)卡的研制;（二）抗念珠狀鏈桿菌單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、膠體金免疫層析檢測(cè)(gold immunochromatography assay,GICA)，以其特異、敏感、快速的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原微生物的流行病學(xué)調(diào)查和感染性疾病的臨床診斷。本研究根據(jù)豬鼻支原體感染在人體血清抗體效價(jià)不高，其病原體在人體腔道寄生的特點(diǎn)，確定雙抗體夾心法診斷抗原的GICA檢測(cè)模式。以特異性和敏感性較高的配對(duì)單克隆抗體(McAb)作為診斷試劑，然后進(jìn)行條件篩選和優(yōu)化建立GICA檢測(cè)卡(GICAs)，結(jié)果如下：

2、 首先，層析材料的制備和選擇。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，調(diào)節(jié)還原劑的用量可得到不同粒徑的膠體金，可見光光譜掃描鑒定表明顆粒均勻，粒徑大小符合理論值。選擇合適粒徑的膠體金標(biāo)記McAb，即為金標(biāo)抗體，另一株McAb為包被抗體；對(duì)診斷試劑和層析材料通過層析性能和應(yīng)用效果兩方面進(jìn)行篩選，確定緩沖液環(huán)境，抗體工作濃度等。 其次，GICA的建立和在夾心模式下的整體優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，降低檢測(cè)限，減少非特異性反應(yīng)，提高穩(wěn)定性。 最后，

3、GICA應(yīng)用的初步評(píng)價(jià)。檢測(cè)豬鼻支原體4d的液體培養(yǎng)物，其檢測(cè)限為1.72×10<'3>CFU/mL，檢測(cè)全菌蛋白檢測(cè)限為50ng/100μL；特異性試驗(yàn)表明與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人易感11種細(xì)菌和11種支原體均無交叉反應(yīng)。陽性結(jié)果可在5min內(nèi)判定，弱陽性結(jié)果需時(shí)約10min。批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性好，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明其4℃保存6個(gè)月以上在檢測(cè)限以上仍能得到清晰的陽性結(jié)果。 本文研制的GICAs檢測(cè)豬鼻支原體特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡(jiǎn)

4、單、結(jié)果快速，可用于感染的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。 目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏針對(duì)SM的快速檢測(cè)試劑盒，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法需時(shí)較長(zhǎng)且該菌易形成L形變異，PCR方法檢測(cè)步驟較為繁瑣且容易受條件限制，均不適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隱性感染和臨床感染病例的快速診斷。本文以經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備抗SM單克隆抗體，為進(jìn)一步建立以血清學(xué)診斷試劑為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。 首先，抗SM單克隆抗體的制備。以SM全菌蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過基

5、礎(chǔ)免疫、加強(qiáng)免疫3次以上，待免疫血清抗體效價(jià)達(dá)到l：10<'5>以上后進(jìn)行沖擊免疫，3天后取脾細(xì)胞，與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞融合，以甲基纖維素半固體法進(jìn)行克隆，亞克隆3次，以間接ELISA方法對(duì)克隆后的細(xì)胞株進(jìn)行篩選，最后共篩選出12株分泌抗體陽性的融合細(xì)胞株。 其次，抗SM單克隆抗體的鑒定。通過染色體計(jì)數(shù)試驗(yàn)證明12株細(xì)胞皆為雜交瘤細(xì)胞；亞類測(cè)定證實(shí)其分屬于IgG<,1>、IgG<,2a>、IgG<,2b>以及IgM類

6、；Westem-blot實(shí)驗(yàn)表明單抗5G4結(jié)合的抗原分子量為32x 10<'3>，6D10結(jié)合的抗原分子量為66x10<'3>，5B9結(jié)合的抗原分子量有2個(gè)條帶，在60-67×10<'3>之間，為SM種特異性抗原；IFA結(jié)果顯示，單抗5G4能夠與SM表面抗原結(jié)合；ELISA實(shí)驗(yàn)初步表明單抗5G4與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見病原菌無交叉反應(yīng)，提示單抗5G4有可能作為診斷抗體直接檢測(cè)抗原或者作為診斷抗原純化的親和層析配體。在后續(xù)SM血清學(xué)診斷方法的研究中