綠盲蝽溫度受體基因的鑒定及功能研究.pdf

1、昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、遷飛、滯育、休眠等生命活動(dòng)和重要的行為與溫度變化息息相關(guān)。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，快速感知外界環(huán)境溫度變化并迅速做出相應(yīng)的行為反應(yīng)對(duì)于昆蟲(chóng)的正常生存和繁衍極其重要。以前的研究表明瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential，TRP）參與了昆蟲(chóng)對(duì)溫度的感知行為，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)體內(nèi)溫度的受體。綠盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)屬于半翅目(Hemiptera)，盲蝽科

2、(Miridae)，草盲蝽屬（lygus Hahn），是我國(guó)多種農(nóng)作物和果樹(shù)上的重要害蟲(chóng)。本論文通過(guò)生物信息學(xué)方法分析綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了綠盲蝽兩個(gè)溫度受體基因（TRPA1和Painless）的片段，通過(guò)PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了編碼TRPA1和Painless的全長(zhǎng)cDNA序列;分析了TRPA1及Painless基因在綠盲蝽不同發(fā)育階段及成蟲(chóng)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量;通過(guò)真核表達(dá)結(jié)合雙電極電壓鉗記錄揭示了綠盲蝽TRPA1及Pain

3、less基因的功能，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了綠盲蝽對(duì)溫度及化合物刺激的行為反應(yīng)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.完成了綠盲蝽TRPA1基因的鑒定及功能研究。在觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法獲得了綠盲蝽TRPA1基因的4個(gè)序列片段，通過(guò)序列比對(duì)，結(jié)合分子克隆技術(shù)得到綠盲蝽TRPA1基因的四個(gè)剪切型的全長(zhǎng)序列，分別命名為AlucTRPA1-A、AlucTRPA1-B、AlucTRPA1-C、AlucTRPA1-D。四個(gè)剪切型均包含6

4、個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域及16個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，該基因在1至5齡若蟲(chóng)及成蟲(chóng)中均有表達(dá)，且1齡若蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量最高;在成蟲(chóng)的不同組織中，觸角中的表達(dá)量最高。四種剪切型僅在腹部及翅的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。體外功能研究表明，除了AlucTRPA1-D，其他三種剪切型均可被20-40℃逐漸上升的溫度激活，而且重復(fù)刺激不會(huì)引起通道的鈍化。AlucTRPA1-A及AlucTRPA1-B的激活溫度小于25℃，而AlucTRPA1-C的激活溫度在25-30

5、℃之間。除了對(duì)溫度的反應(yīng)外，四種剪切型中，僅AlucTRPA1-A和AlucTRPA1-C對(duì)刺激性化合物異硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛(CA)及香茅醛（citronellal）有明顯反應(yīng)。
　　2.完成了綠盲蝽Painless基因的鑒定及功能研究。利用生物信息學(xué)方法得到綠盲蝽Painless基因的4個(gè)cDNA片段，通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到綠盲蝽Painless基因的全長(zhǎng)序列，命名為AlucPainless。該基

6、因全長(zhǎng)2736 bp，編碼911個(gè)氨基酸，蛋白結(jié)構(gòu)包含6個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域及8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列。時(shí)空表達(dá)譜分析結(jié)果表明，AlucPainless基因在整個(gè)生命周期均有表達(dá)，1齡若蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量最高;在成蟲(chóng)的不同組織中，足中的表達(dá)量最高，頭中最低?；谧嘎涯讣?xì)胞的體外功能研究表明，10-3 mol/L的刺激性化合物不能激活A(yù)lucPainless通道。20-45℃逐漸上升的溫度可以激活A(yù)lucPainless通道。由于AlucPainl

7、ess通道在20-25℃、20-30℃、20-35℃及20-40℃溫度區(qū)間的反應(yīng)值與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，因此AlucPainless基因的激活溫度大于40℃。
　　3.完成了綠盲蝽對(duì)溫度、氣味刺激的行為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。綠盲蝽在溫度梯度平板上的分布主要集中于25-28℃，綠盲蝽在高溫區(qū)沒(méi)有分布，表明綠盲蝽能夠感知環(huán)境溫度。雙向選擇實(shí)驗(yàn)表明1％ CA、10％ CA、1％ citronellal及10％ citronellal趨避綠盲蝽，而綠