肝細(xì)胞特異性絲素蛋白基大孔微載體的制備與研究.pdf

1、隨著對(duì)肝衰竭病理生理認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到對(duì)肝功能衰竭的體外支持不僅要清除毒素，而且還需要提供更全面的肝臟功能支持，包括替代肝臟的解毒，合成，轉(zhuǎn)化及分泌等功能。生物型人工肝和組合型人工肝就是基于上述理論設(shè)計(jì)的，生物型人工肝是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的體外人工肝支持系統(tǒng)。所謂生物型人工肝是指在組成中含有活的生物成分如活的器官，組織或細(xì)胞的人工肝支持系統(tǒng)。其核心部分生物反應(yīng)器是由肝細(xì)胞與生物合成材料組合而成；如何建立具有質(zhì)量高、細(xì)胞

2、數(shù)量足、安全性強(qiáng)的生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)是目前生物型人工肝研究領(lǐng)域最重要、也是最困難的核心技術(shù)問(wèn)題。肝細(xì)胞是具有極性的錨定依賴性細(xì)胞，需要一種不溶的細(xì)胞外基質(zhì)才能獲得生存、重組、增殖并發(fā)揮功能，支架材料的生物相容性和細(xì)胞黏附能力是至關(guān)重要的。近幾年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到基質(zhì)材料在組織工程中占有重要地位，基質(zhì)材料既是信號(hào)分子或細(xì)胞的載體，又是新生組織生長(zhǎng)的支架。因此，尋找適宜的基質(zhì)材料，研究其與組織和細(xì)胞的相互作用，探索信號(hào)分子、細(xì)胞與載體的組裝

3、模式，是組織工程研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。近年來(lái)微載體在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究正日趨升溫，主要是利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行組織工程種子細(xì)胞的擴(kuò)增和用來(lái)充當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞治療的傳輸載體。相比于實(shí)心微載體，大孔微載體的優(yōu)勢(shì)在于為細(xì)胞提供了足夠的生長(zhǎng)空間和更大的附著面積，有利于營(yíng)養(yǎng)成分的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出，提高了細(xì)胞培養(yǎng)密度和代謝活性。隨著對(duì)組織工程支架材料研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)高分子材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改性、表面修飾等處理可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在支架

4、材料上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面，以半乳糖基修飾各種天然的和人工聚合物，通過(guò)肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體和聚合物鏈上高濃度的半乳糖基之間獨(dú)特的分子識(shí)別功能，可以提高肝細(xì)胞的特異功能。半乳糖基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特異性配體，是肝細(xì)胞識(shí)別的相應(yīng)位點(diǎn)并能產(chǎn)生特異性相互作用。在肝組織工程細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上引入半乳糖基，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支

5、架材料上的黏附和增殖行為。 目的: 以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料，首先在殼聚糖上接枝半乳糖基，然后將絲素蛋白（Silk Fibroin）與半乳糖基化殼聚糖（Galactosylated Chitosan）復(fù)合，將肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特異性配體——半乳糖基引入材料中，制備出一種具有肝細(xì)胞特異性的高性能的大孔微載體。 方法:

6、 首先在EDC和NHS的活化作用下在殼聚糖上接枝半乳糖基；然后將絲素蛋白（SF）和半乳糖基化殼聚糖（GC）按照一定比例混合，綜合應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出一種具有多孔結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞特異性SF/GC大孔微載體。并初步測(cè)定了SF/GC大孔微載體吸水率及密度；利用倒置顯微鏡、掃描電鏡等觀察大孔微載體的形貌；對(duì)半乳糖基化殼聚糖進(jìn)行1HNMR譜表征；利用FITR譜對(duì)SF/CS、SF/GC大孔微載體材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征

7、；通過(guò)將人肝細(xì)胞系CL-1細(xì)胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)SF/GC大孔微載體與肝細(xì)胞的生物相容性；并對(duì)SF/GC大孔微載體的消毒方法進(jìn)行了初步探討，利用高壓蒸汽滅菌法對(duì)SF/GC大孔微載體進(jìn)行滅菌，并從滅菌前后大孔微載體的形態(tài)變化、細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果、化學(xué)結(jié)構(gòu)是否改變等方面探討高溫高壓滅菌法對(duì)SF/GC大孔微載體的影響。 結(jié)果: 本課題以生物相容性良好的天然高分子材料絲素蛋白、殼聚糖為原料，在EDC和NHS的活化作用下

8、成功地在殼聚糖上接枝了半乳糖基。通過(guò)將SF與GC復(fù)合，應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出了一種肝細(xì)胞特異性SF/GC大孔微載體。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察該大孔微載體表面呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為40-80μm，開口向外，呈喇叭狀，孔的分布均勻，內(nèi)部亦為多孔結(jié)構(gòu)，適合于肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)。并通過(guò)1HNMR譜、FITR譜表征，證實(shí)半乳糖基已經(jīng)成功復(fù)合到支架材料之中。該支架材料中引入了肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的

9、特異性配體——半乳糖基，半乳糖基是肝細(xì)胞識(shí)別的相應(yīng)位點(diǎn)并能產(chǎn)生特異性相互作用，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附和增殖行為；從而具有肝細(xì)胞親和性，有助于細(xì)胞黏附、增殖，支持大量細(xì)胞生長(zhǎng)，并能長(zhǎng)期維持細(xì)胞活性和細(xì)胞功能。初步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明肝細(xì)胞能與材料特異性黏附、細(xì)胞圍繞微載體聚集生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出很好的活力。將SF/GC大孔微載體與CL-1細(xì)胞在RCCS生物反應(yīng)器中共培養(yǎng)時(shí)，肝細(xì)胞呈多細(xì)胞聚集的團(tuán)塊，由于肝細(xì)胞表面ASGPR和支

10、架上半乳糖基之間的分子識(shí)別功能，細(xì)胞附著牢固，且肝細(xì)胞能夠進(jìn)入孔中生長(zhǎng)，適合于肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)SF/GC大孔微載體的消毒方法的探討，證實(shí)了本課題制備出的SF/GC大孔微載體通過(guò)傳統(tǒng)的高壓蒸汽滅菌后，材料的主要性能沒(méi)有改變。 結(jié)論: （1）以絲素蛋白、殼聚糖為原料，通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行半乳糖基化修飾，然后將SF與GC復(fù)合，應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法可制備出具有肝細(xì)胞特異性親和力的SF/GC大孔微載

11、體；（2）由于肝細(xì)胞表面ASGPR和SF/GC大孔微載體上半乳糖基之間的分子識(shí)別功能，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在SF/GC大孔微載體支架材料上的黏附和增殖行為，因而具有肝細(xì)胞特異性；（3）本課題制備出的SF/GC大孔微載體可應(yīng)用傳統(tǒng)的高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌。本課題研究制備出的SF/GC大孔微載體具有肝細(xì)胞親和性，有助于細(xì)胞黏附、增殖、長(zhǎng)期維持細(xì)胞活性和功能，將會(huì)在肝組織工程，特別是生物人工肝的研究領(lǐng)域發(fā)揮積極的作用。隨著對(duì)材料-細(xì)胞相互作用研