Rap1GAP通過ERK和Akt途徑抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移的實驗研究.pdf

1、研究目的:Rap1是小分子G 蛋白Ras 家族成員之一，體外的實驗已經(jīng)證明 Rap1在細胞內(nèi)發(fā)揮多種作用。Rap1 對內(nèi)皮細胞的作用主要是參與對內(nèi)皮細胞間粘連形成、通透性等功能的調節(jié)。最近的研究表明，在內(nèi)皮細胞中，Rap1 不僅僅局限于細胞粘連，而且可以調節(jié)內(nèi)皮細胞對一些促進血管新生刺激因素的反應。換句話說，Rap1在體內(nèi)可以作為一種正性血管新生調節(jié)因素。Rap1GAP是小分子G 蛋白Rap1的GTP 酶激活蛋白，它可以加速Rap1 由

2、與GTP結合的活化形式轉變?yōu)榕cGDP 結合的去活化形式的過程。一些研究者發(fā)現(xiàn)Rap1GAP可以失活Rap1，抑制Rap1 介導的血管新生。但也有一些實驗結果并不支持這一結論。因此，很有必要進一步研究Rap1GAP在血管新生的作用。揭示Rap1GAP在血管新生的作用有利于進一步了解血管新生的機理，并且能為與血管新生相關疾病提供一個新的、特異的研究切入點。
　　 血管新生是微血管從已經(jīng)存在的血管床以出芽的方式長出,并逐漸形成新的血管

3、分支及毛細血管叢的過程，它由一系列相互協(xié)調密切配合的過程來組成的，許多因素參與了對其的調節(jié)。PI3K/Akt和ERK 信號通路廣泛參與細胞的有絲分裂、代謝運動、生存、凋亡和分化等過程。其在血管新生中的作用也越來越受到重視。所以，設想Rap1GAP是通過PI3K/Akt和ERK 信號通路來實現(xiàn)其在血管新生中的作用。
　　 本研究的目的就在于研究Rap1GAP在血管新生中的作用機理。研究方法首先通過人臍靜脈獲得內(nèi)皮細胞后對其培養(yǎng)、擴

4、增。利用Fugene 6 轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞，使其高表達Rap1GAP。然后通過BrdU-ELISA 方法檢測轉染Rap1GAP后，內(nèi)皮細胞增殖變化情況，利用Transwell 小室測定內(nèi)皮細胞的遷移能力，通過體外管腔形成實驗檢測微血管樣結構的形成情況。
　　 為了研究Rap1GAP 對內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用的機理及信號傳導通路，通過免疫印跡的方法檢測內(nèi)皮細胞轉染Rap1GAP后ERK、Akt 磷酸化的變化情況。同時進一步觀察ERK和

5、Akt 信號傳導通路特異拮抗劑對內(nèi)皮細胞細胞增殖、遷移的影響。最后，對轉染有Rap1GAP的HUVECs 給予外源性VEGF 刺激后觀察其增殖、Cyclin D1以及ERK、Akt 磷酸化的變化情況，從而研究Rap1GAP 對VEGF 促進內(nèi)皮細胞增殖是否影響及作用機制。
　　 實驗結果:
　　 1.高表達的Rap1GAP 能夠抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和體外管腔形成能力。
　　 2.Rap1GAP 能夠抑制Rap