CD147、MMP-2在人腦膠質瘤中的表達及CD147單抗抑制U251細胞侵襲性的實驗研究.pdf

1、目的：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在惡性腫瘤侵襲與轉移中發(fā)揮重要作用，而CD147作為．MMPs的誘導因子，可促進腫瘤及間質細胞表達MMPs。本研究旨在：(1)探討CD147和MMP-2在人腦膠質瘤中的表達與腫瘤的級別、侵襲及預后的關系；(2)在體外試驗中運用CD147基因工程單抗影響膠質瘤細胞表面CD147的表達，探討其對腫瘤侵襲性的抑制作用及其作用機理。 方法： 1．

2、標本來源：收集四川大學華西醫(yī)院2001年至2004年間50例腦膠質瘤標本，男性28例，女性22例，年齡22～67歲，平均年齡48．2歲，根據WHO分類，膠質瘤Ⅰ　級5例，Ⅱ級18例，Ⅲ級9例，Ⅳ級18例，對照組10例為內減壓術中切除的正常腦組織。體外實驗采用人腦膠質母細胞瘤細胞株U251和鼠成纖維細胞株NIH3T3進行細胞培養(yǎng)。 2．主要試劑： CD147、MMP-2、MT1-MMP、MT2-MMP均為鼠抗人單克隆抗體、S-P免

3、疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、CD147基因工程單克隆抗體。 3．方法：將膠質瘤和對照腦組織新鮮冰凍標本做RT-PCR對各級別CD147的mRNA進行半定量分析；并石蠟切片進行免疫組化染色，檢測各級別膠質瘤和對照標本CD147和MMP-2的表達水平，結合隨訪資料進行預后分析。細胞培養(yǎng)分組：第一組成纖維細胞NIH3T3；第二組CDl47陽性表達人膠質母細胞瘤細胞株U251；第三組不同濃度U251+NIH3T3細胞。第四組：在不同

4、濃度U251+NIH3T3細胞共同培養(yǎng)組中分別加入不同劑量的CD147基因工程單抗共同孵育以封閉細胞表面CD147分子表達，用明膠酶譜實驗(Zymography)檢測分析各組細胞及共同孵育組酶原型MMP-2及激活型MMP-2蛋白表達量，Western-blot檢測各組細胞及共同孵育組CD1-47、MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表達量，根據信號強弱分析蛋白表達量。以上資料均作統(tǒng)計學分析。 4．統(tǒng)計學方法：各組間計量

5、資料的比較采用方差分析，兩組間計數(shù)資料比較采用x<'2>檢驗，非參數(shù)秩和檢驗，Spearman等級相關性分析，檢驗水準為a=0.05(雙側)，所有數(shù)據分析均在SPSS12.0軟件中完成。 結果： 1．免疫組化檢測各級別膠質瘤標本中均有CD147和MMP-2的表達，RT-PCR檢測到各級別膠質瘤標本中CD147 mRNA的表達，隨著膠質瘤級別增高，CD147和MMP-2表達陽性率增高，CD147 mRNA表達水平也增高，對

6、照組為弱表達或無表達，差異有統(tǒng)計學意義。 2．在細胞培養(yǎng)研究中，Zymography檢測顯示，在藍色背景呈兩條不同分子量的白色酶裂解明膠條帶：酶原型MMP-2(68-kDa)和激活型MMP-2(62-kDa)，含有NIH3T3細胞的培養(yǎng)組均有兩種條帶顯示，隨細胞種類及濃度不同兩種酶含量亦不相同，U251+NIH3T3細胞共同培養(yǎng)組中兩種酶含量最高，隨著U251細胞濃度的增高，激活型高于酶原型，單獨U251細胞培養(yǎng)組兩種酶含量呈弱

7、表達或無表達。同時Western-blot檢測顯示，U251組CD147蛋白表達明顯，酶原型MMP-2呈弱表達或無表達，NIH3T3組無CD147蛋白表達，酶原型MMP-2有表達，兩種細胞共同培養(yǎng)組中酶原型MMP-2較強，兩種細胞與CD147基因工程單抗共同孵育組酶原型MMP-2蛋白表達減弱，隨著CD147基因工程單抗劑量增加酶原型MMP-2蛋白表達逐漸減弱，差異有統(tǒng)計學意義，提示CD147基因工程單抗對酶原型MMP-2蛋白表達量呈劑量

8、依賴性抑制作用。Western-blot檢測各實驗組MT1-MMP和MT2-MMP蛋白的表達結果與酶原型MMP-2相似，且CD147基因工程單抗對MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表達量也呈劑量依賴性抑制作用。 結論：CD147和MMP-2在人腦膠質瘤侵襲性生長過程中起重要作用，在人腦膠質瘤中CD147和MMP-2呈高表達，且隨級別增高而增強，在高級別膠質瘤中表達最強。在體外實驗中，己1251+NIH3T3細胞共同培養(yǎng)組中U25

9、1細胞表達的CD147刺激成纖維細胞產生MMP-2和膜型MMPs(MT1-MMP和MT2-MMP)，MT1-MMP和MT2-MMP作為MMP-12的激活因子可激活酶原型MMP-2；CD147基因工程單抗可以抑制U251細胞CD147的表達和生物學活性，從而抑制MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP的分泌，使腫瘤侵襲生長受到抑制。CD147和MMP-2表達水平可作為膠質瘤患者判斷臨床預后和制定診療計劃有意義的參考指標，為腦膠質瘤靶向治